石藝婷，何英杰，3，陳蕓，唐其，4*，譚海燕，劉東波，2，4，謝紅旗，2，3，4*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.國家中醫(yī)藥管理局 亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.湖南省中獸藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128

枳殼為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，是國家規(guī)定的114種可用于中藥類保健食品原料之一，主要分布于四川、重慶、湖南、江西等省，其中屬“湘枳殼”產(chǎn)量較大，為大宗中藥材[1-2]。枳殼性微寒，味酸苦，歸脾胃經(jīng)，用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、臟器下垂等，具有調(diào)節(jié)胃腸動力、抗氧化、利膽排石及抗抑郁等多種功效[3-5]。

枳殼中有效成分主要有黃酮、三萜、多糖、多酚、少量揮發(fā)油及生物堿等[6-7]。黃酮類化合物主要為二氫黃酮，如柚皮苷、新橙皮苷等，具有抗氧化、抗炎、抗癌抑菌等作用[8-10]；三萜類成分以檸檬苦素為代表，具有抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等生物活性[11-12]；多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖構(gòu)成，能有效促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖，具有一定免疫增強(qiáng)活性[13-15]；多酚類物質(zhì)具有良好的生物活性，主要表現(xiàn)在抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抑制肥胖等方面，是近年來的研究熱點(diǎn)之一，而目前關(guān)于枳殼多酚的報道較少[6，16-17]，但同屬中藥枳實(shí)中多酚具有一定的抗氧化活性，并能抑制脂肪酶和葡萄糖苷酶活力[18]。

中藥類保健食品的研究開發(fā)主要包括配方、工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究為基礎(chǔ)保障[19]。而關(guān)于枳殼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制一般以《中華人民共和國藥典》為準(zhǔn)，即以柚皮苷和新橙皮苷的含量為評價指標(biāo)，由于控制指標(biāo)少，不能全面真實(shí)反映產(chǎn)品的質(zhì)量。基于已有的研究，本文選擇枳殼的特征性成分柚皮苷、新橙皮苷、多酚、三萜以及多糖的含量為質(zhì)量指標(biāo)，通過Criteria Importance Through Inter-criteria Correlation法，即CRITIC客觀賦值法，建立枳殼綜合質(zhì)量評價體系，分析并比較了以湘枳殼為主的12個枳殼樣品的品質(zhì)，旨在構(gòu)建一種客觀的評價體系來反映枳殼的藥材質(zhì)量，為今后枳殼在中藥保健品等領(lǐng)域的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DHG-9246A烘箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；YS-20粉碎機(jī)(北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司)；XS205分析天平(德國METTLER TOLEDO公司)；KM5200DV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；2-16R高速離心機(jī)(恒諾儀器公司)；UV-1800紫外分光光度計(日本島津公司)；1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 試藥

柚皮苷對照品(Naringin，上海源葉生物有限公司，批號：B12594)、檸檬苦素對照品(Limonin，上海源葉生物有限公司，批號：B20911)、新橙皮苷對照品(Neohesperidin，上海源葉生物有限公司，批號：B21390)；一水合沒食子酸、葡萄糖(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、碳酸鈉、福林酚、三氯化鋁、蒽酮、硫酸(上海國藥集團(tuán)試劑有限公司，分析純)。

枳殼樣品經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)專業(yè)王智老師鑒定為正品，具體信息見表1。

表1 枳殼樣品信息

2 方法

2.1 樣品處理

將枳殼干樣置60 ℃烘箱中，烘干24 h，然后取適量藥材置植物粉碎機(jī)中粉碎，再過80目篩，即得。

2.2 柚皮苷、新橙皮苷含量測定

2.2.1 色譜條件 參考《中華人民共和國藥典》(2015版)及相關(guān)研究[3，20]中的方法稍作改進(jìn)。采用Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫程序：0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～18%B；10～15 min，18%～20%B；15～20 min，20%～22%B；20～25 min，22%B；25～30 min，22%～25%B；檢測波長為284 nm；色譜柱溫度為30 ℃；流動相流速為0.7 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品柚皮苷0.44 mg、新橙皮苷0.40 mg，用甲醇溶解并定容到1.0 mL，制成混合對照品儲備液，分別取儲備液稀釋到質(zhì)量濃度為0.43～225 μg·mL-1，過0.45 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析，并以相應(yīng)對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y)。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取干燥的枳殼粉末(AF-1～AF-12)50.00 mg置于錐形瓶中，按料液比1∶100，分別加入50.0 mL甲醇，密封后稱質(zhì)量，超聲提取30 min后再稱質(zhì)量，再用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，抽濾，取濾液于4 ℃貯存，備用。

2.2.4 柚皮苷、新橙皮苷含量測定 取2.2.3制備的供試品溶液過0.45 μm濾膜后，按照2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行定量分析。

2.3 多酚含量測定

2.3.1 枳殼樣品處理 按2.2.3的方法操作。

2.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用福林酚顯色法，參考文獻(xiàn)[21-22]方法。稱取一水合沒食子酸對照品110.00 mg，用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液；分別移取適量溶液配制成10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg·mL-1的對照品溶液。分別移取各濃度的對照品溶液0.5 mL于試管中，依次加入蒸餾水2.5 mL、福林酚試劑0.5 mL和7.5%碳酸鈉溶液1.5 mL，室溫下顯色2 h，以沒食子酸對照品溶液為參比溶液，用紫外分光光度計于760 nm波長下測定吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 多酚含量測定 取各樣品溶液10.0 μL，加甲醇至0.5 mL，并用甲醇溶液作參比溶液，按照2.3.2的方法進(jìn)行測定。

2.4 三萜含量測定

2.4.1 供試品溶液制備 按照2.2.3方法，制備供試品溶液后將其稀釋3倍，備用。

2.4.2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線 參考文獻(xiàn)[23-24]的方法，精密稱量檸檬苦素對照品1.20 mg，用甲醇定容至5.0 mL。分別移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.70 mL檸檬苦素溶液于試管中，用甲醇補(bǔ)足到1.00 mL，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL、高氯酸1.0 mL，搖勻，60 ℃水浴加熱15 min后冰水浴冷卻，再加入5.00 mL冰醋酸，室溫靜置15 min后于548 nm波長處測定吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.3 三萜含量測定 取各樣品溶液0.10 mL，加甲醇至1.00 mL，以甲醇溶液為參比，按照2.4.2的方法進(jìn)行測定。

2.5 多糖含量測定

2.5.1 供試品溶液制備 稱取各枳殼樣品1.00 g分別加入20.0 mL甲醇，超聲脫脂30 min后抽濾，繼續(xù)加入20.0 mL甲醇溶液，重復(fù)上述操作，得濾渣，置通風(fēng)櫥中吹干，再往濾渣中加入30.0 mL蒸餾水，沸水加熱提取30 min，重復(fù)操作兩次后合并濾液，減壓濃縮至一定體積，加入適量乙醇，4 ℃過夜保存后高速離心10 min，棄上清液，得多糖沉淀，加蒸餾水溶解后定容至50.0 mL。

2.5.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用蒽酮-硫酸法[15，25]，精密稱取干燥的葡萄糖對照品10.00 mg，加蒸餾水定容得質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1葡萄糖對照品溶液。分別精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL上述溶液于試管中，用蒸餾水補(bǔ)足到2.0 mL，再往各試管加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6.0 mL，迅速搖勻，室溫反應(yīng)15 min后冰水浴15 min；以2.0 mL蒸餾水作參比溶液，于625 nm處測定吸光度。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.3 多糖含量測定 依照2.5.2的方法并計算出多糖含量。

2.6 數(shù)據(jù)處理

對所得數(shù)據(jù)通過Excel 2010軟件進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 枳殼有效成分含量測定

3.1.1 線性回歸方程 按實(shí)驗(yàn)方法操作，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，各對照品溶液的峰面積或吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)，得到柚皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、檸檬苦素、葡萄糖對照品的線性回歸方程，見表2。結(jié)果表明，各對照品的質(zhì)量濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。

表2 各對照品線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

3.1.2 含量測定結(jié)果 通過高效液相色譜法和紫外分光光度法，測定不同產(chǎn)地枳殼有效組分的含量，將各樣品3次測定結(jié)果的平均值列于表3。由表3可知，以《中國人民共和國藥典》(2015版)為指導(dǎo)，即枳殼中柚皮苷含量不能低于4.0%，各樣品均符合要求；新橙皮苷含量不能低于3.0%，除AF-1、AF-4和AF-10外其余樣品均符合要求。

表3 枳殼5個指標(biāo)測定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3.2 CRITIC賦值法分析

3.2.1 CRITIC法原理 CRITIC法是一種與主觀權(quán)重賦值法相比更為科學(xué)可靠的客觀賦值法。它是通過各指標(biāo)間的對比強(qiáng)度和沖突性來綜合衡量其客觀權(quán)重[26-28]。對比強(qiáng)度表示同一指標(biāo)各個類別之間取值差距的大小，以標(biāo)準(zhǔn)差的形式表現(xiàn)出來，用σj表示，即σj越大則同一指標(biāo)內(nèi)各類別之間的差距越大。各指標(biāo)間的沖突性以指標(biāo)之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)，通常用Rj表示，如果指標(biāo)之間具有較強(qiáng)的正相關(guān)，說明這兩個指標(biāo)的沖突性較低，則表明這兩個指標(biāo)反映的信息較為相似。

設(shè)Cj為第j個指標(biāo)所包含的信息量，Cj越大，則第j個指標(biāo)所包含的信息量越大，該指標(biāo)的相對重要性越大，客觀權(quán)重Wj就越大。

(1)

Cj=σjRj

(2)

(3)

其中，rij為指標(biāo)i與j之間的相關(guān)系數(shù)。

3.2.2 相關(guān)性分析 采用Excel 2010軟件分析上述指標(biāo)間的相關(guān)性，結(jié)果見表4。由表4可知，柚皮苷含量與其他4個指標(biāo)均呈較好的相關(guān)性，其中與多糖含量的相關(guān)系數(shù)為0.550，與多酚含量的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.698；而新橙皮苷含量僅與多酚含量有良好的相關(guān)性，為0.733；多酚含量與三萜含量之間也有較大的相關(guān)性；而多糖含量與三萜含量呈一定的負(fù)相關(guān)。

表4 各指標(biāo)間的相關(guān)性

注：—表示數(shù)據(jù)已有，不再重復(fù)。

3.2.3 CRITIC法分析 本實(shí)驗(yàn)采用CRITIC法對枳殼中柚皮苷、新橙皮苷、多酚、三萜以及多糖含量進(jìn)行權(quán)重賦值，并以此作為枳殼品質(zhì)的評價指標(biāo)。首先按照標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)=(該次試驗(yàn)值-試驗(yàn)最小值)/(試驗(yàn)最大值-試驗(yàn)最小值)，對表3的數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后根據(jù)3.2.1的公式計算各指標(biāo)的對比強(qiáng)度、沖突性、信息量和客觀權(quán)重，結(jié)果見表5。

表5 評價指標(biāo)的對比強(qiáng)度、沖突性、信息量和客觀權(quán)重

由上表可知，各指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)分別為0.115、0.194、0.171、0.237和0.284，故將加權(quán)得分公式設(shè)定如下。

Y=(柚皮苷含量/柚皮苷最大含量)×0.115×100+(新橙皮苷含量/新橙皮苷最大含量)×0.194×100+(多酚含量/多酚最大含量)×0.171×100+(三萜含量/三萜最大含量)×0.237×100+(多糖含量/多糖最大含量)×0.284×100

(4)

根據(jù)公式計算各枳殼樣品的得分和排序結(jié)果見表6。

表6 CRITIC法得分表

由上表可知，樣品的得分范圍為42.003～92.936。由表5可知，多糖含量的信息量、所占的客觀權(quán)重均較其他指標(biāo)大，因此它對加權(quán)公式的影響也最大；三萜含量的信息量和客觀權(quán)重僅次于多糖，對加權(quán)得分也有較大影響。

而由表3可知，多糖含量排在前3位的樣品編號依次是AF-5、AF-10、AF-11，三萜含量排在前3的分別是AF-7、AF-3、AF-5，而最終得分前3名為AF-7、AF-12、AF-5。由表3可知，AF-7各項(xiàng)指標(biāo)含量均比較高，尤其是柚皮苷、三萜及多酚的含量均位于第一，因而最終得分最高，品質(zhì)最好；AF-12雖然只有新橙皮苷含量最高，但其他指標(biāo)排名都比較靠前，得分也相應(yīng)較高。而AF-5有3項(xiàng)指標(biāo)位于前3，其中屬多糖含量最高，另外兩項(xiàng)得分雖相對靠后，但其對加權(quán)公式影響較小，最終得分依然較高。排名靠后的3個樣品的編號分別是AF-10、AF-1和AF-4，它們各指標(biāo)含量均比較靠后，尤其是AF-4，所有指標(biāo)值均在最后3名內(nèi)，品質(zhì)較差。

從產(chǎn)區(qū)來看，產(chǎn)自三眼塘鎮(zhèn)的AF-5、AF-7得分高，排名靠前，較沅江其他產(chǎn)地品質(zhì)更佳；而同產(chǎn)于三眼塘鎮(zhèn)的AF-6各指標(biāo)值較低，排名相對靠后，推測與栽培技術(shù)、采收時間等有關(guān)，具體原因還有待研究。在各產(chǎn)地中，屬沅江南咀鎮(zhèn)的樣品得分最低，品質(zhì)較差。

4 結(jié)論

隨著中藥保健食品概念的推廣，人們逐漸開始意識到防治未病的重要性，功能食品的保健功效也越來越受到重視，而枳殼作為一種常用的理氣藥，在保健品等領(lǐng)域的開發(fā)尚處于起步階段。枳殼中所含的黃酮類、多酚類、三萜以及多糖類化合物是其主要的有效活性成分，具有較強(qiáng)的藥理作用及保健功效，通過測定這些有效成分的含量，并基于CRITIC客觀賦值法建立可以客觀反映不同來源枳殼質(zhì)量的評價體系，為今后枳殼在功能產(chǎn)品的開發(fā)利用領(lǐng)域提供借鑒。