趙正，李琦，尹婕，孫立東，冉慶森，李玉潔，王婭杰，陳穎，楊慶，翁小剛，蔡維艷，朱曉新

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種內(nèi)源性促炎和抗炎失衡所引起的慢性炎癥性疾病[1-2]。巨噬細(xì)胞跨膜蛋白B型清道夫受體-CD36可以無限制地?cái)z取氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，形成膽固醇負(fù)載的泡沫細(xì)胞[3-4]，而巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的凋亡是被公認(rèn)為形成AS壞死核心的關(guān)鍵步驟[5]。ox-LDL可促使巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase-12，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-8]。而巨噬細(xì)胞的大量凋亡、炎癥消散功能的缺失、斑塊的不穩(wěn)定性均與ERS機(jī)制相關(guān)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)[6，11]，通過緩解ox-LDL誘導(dǎo)的ERS，抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，同時(shí)加強(qiáng)清除脂質(zhì)和凋亡細(xì)胞的能力，可以達(dá)到抗炎與促炎癥消散平衡的過程。因此，從炎癥消散的角度，提高巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)過氧化物清除的有效性，有利于減緩AS的進(jìn)展。

參蓮(SL)提取物是以丹參和穿心蓮不同有效部位按照臨床劑量5∶3進(jìn)行配伍，在活血化瘀的基礎(chǔ)上引藥入心，清解血分毒熱[12]。前期研究結(jié)果表明，SL提取物能夠有效抑制AS模型小鼠斑塊的形成[13]，改善促炎介質(zhì)和炎癥消散介質(zhì)的失衡[14]，抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的極化[15]。然而SL提取物能否以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)，通過緩解脂質(zhì)過氧化物誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)炎癥消散，干預(yù)AS炎癥，是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)以ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞炎癥損傷為模型，研究SL提取物對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡的藥效以及不同提取部位之間的活性比較。

1 材料

HWS-350型細(xì)胞培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)，IX81倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，Centrifuge 5424R型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendoff公司)，Centrifuge LEGEND RT+型超高速吊籃離心機(jī)(美國Thermo公司)，DYY-6D型電泳儀(北京市六一儀器廠)，spectra max plus 384連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司)。

氧化型低密度脂蛋白(北京欣盛澤科技有限公司)，衣霉素(美國Sigma公司，貨號(hào)：654380)，Brewer改良巰基乙醇酸鹽肉湯(美國BD公司，貨號(hào)：6091782)，二甲基亞砜(DMSO，美國amresco公司，貨號(hào)：2075C127)，油紅O染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：DL0009A6)，鈣離子熒光染料Fluo-3 AM(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：F8841)，Pluronic F127(美國Sigma公司，貨號(hào)：P2443)，Hepes緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：H1095)，Hanks平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：H1045)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(美國BD公司，貨號(hào)：556547)，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C1116)，Caspase-12抗體(美國Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：2202)，TEMED(C6H16N2)(美國sigma公司，貨號(hào)：0761)，Tris(三羥甲基氨基甲烷，美國Amresco公司，貨號(hào)：77-86-1)，APS(過硫酸銨，美國Sigma公司，貨號(hào)：A3678)，BSA(牛血清白蛋白V，美國Amresco公司，貨號(hào)：9048-46-8)，RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0013B)，PMSF(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：090616161212)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京普利萊公司，貨號(hào)：PLL-2017-02)。SL提取物由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所化學(xué)室提供(2016年9月中試加工)。

SPF級(jí)6～8周齡C57BL/6J雌性小鼠12只，體質(zhì)量(20±2)g，購于斯坦福北京生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002，批號(hào)：11401500043418；動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫(25±2)℃、濕度(55±5)%的12 h光暗交替的中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.1 樣品制備

SL提取物和各提取部位的制備和質(zhì)量控制詳細(xì)見參考文獻(xiàn)[14]，其中丹參水溶性提取物部位的得率為1.99%，丹參脂溶性提取部位的得率為1.15%，穿心蓮脂溶性提取物的得率為2.43%，按照丹參和穿心蓮臨床劑量5∶3的配伍比例，換算出在SL提取物中，含43.2%丹參水溶性提取物、25%丹參脂溶性提取物和31.8%穿心蓮脂溶性提取物。SL提取物(50 mg)、穿心蓮脂溶性浸膏(15.9 mg)、丹參脂溶性浸膏(12.5 mg)、丹參水溶性浸膏(21.6 mg)充分溶解于DMSO中，儲(chǔ)備液終濃度為50 mg·mL-1。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腹腔巨噬細(xì)胞的提取及分組

3% Brewer改良巰基乙醇酸鹽肉湯1 mL腹腔注射C57BL/6J雌性小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)3 d摘除眼球缺血處死，75%乙醇浸泡10 s后取出，無菌條件下將2 mL RPMI-1640培養(yǎng)基快速注入小鼠腹腔內(nèi)，回抽腹腔灌洗液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，此操作重復(fù)2次，合并灌洗液，1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)細(xì)胞/mL，加入培養(yǎng)板各孔中(每孔2.5 mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁45 min后，洗去未貼壁細(xì)胞，加入DMEM完全培養(yǎng)基(每孔2.5 mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后加藥。分為陰性對(duì)照組(Control)、模型組(Model，ox-LDL，20 mg·L-1)、丹參水溶性提取物組(DS，4.32 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、丹參脂溶性提取物組(DZ，2.5 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、穿心蓮脂溶性提取物組(C，3.18 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、SL提取物組(10 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素組(TM，1 mg·L-1)，其中SL提取物的給藥濃度引用自參考文獻(xiàn)[15]，各提取部位的給藥濃度是以SL提取物10 mg·L-1的給藥濃度與各提取部位的含量相乘計(jì)算得到。

2.3 油紅O染色

腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于放有細(xì)胞爬片的培養(yǎng)板中，細(xì)胞加藥24 h后，用1×PBS洗滌2次；放入ORO Fixative固定15 min；取出涂片，放于流通的空氣中15 min；放入新配置好的ORO Stain，浸染15 min；放入60%的異丙醇漂洗30 s，流水沖洗，放入蒸餾水稍微清洗；放入ORO Buffer 1 min；流水沖洗，晾干。置于倒置顯微鏡下觀察拍照。采用Image Pro-Plus 5.0軟件計(jì)算陽性細(xì)胞的平均分光密度(Integrated OD Average，IA)值(平均分光密度=積分光密度/圖片總面積)。

2.4 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡

藥物處理24 h后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，用1×PBS洗滌兩次，加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入2 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機(jī)前5 min加入2 μL的PI染色。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率，在雙變量流式細(xì)胞儀的二維散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是壞死細(xì)胞，為(FITC+/PI+)；而右下象限是凋亡細(xì)胞，為(FITC+/PI-)。

2.5 Caspase-3的活性檢測(cè)

在收集細(xì)胞中按照每200萬細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min；17 000×g，4 ℃離心12 min；把上清液轉(zhuǎn)移至冰浴預(yù)冷的離心管中；蛋白定量后，按試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)體系：檢測(cè)緩沖液40 μL，待測(cè)樣品40 μL，裂解液10 μL，Ac-DEVD-pNA(2 mmol·L-1)10 μL，總體積為100 μL。37 ℃孵育過夜，酶標(biāo)儀在405 nm波長處檢測(cè)吸光度A值，計(jì)算Caspase-3酶的比活力。

2.6 鈣離子熒光染料Fluo-3 AM測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

Fluo-3 AM溶解于無水DMSO溶液中，加入20% Pluronic F127的DMSO溶液助溶，制備成5 mmol·L-1的儲(chǔ)備液。用HBSS稀釋制備成5 μmol·L-1的Fluo-3 AM工作液。將Fluo-3 AM工作液加入培養(yǎng)體系中，在37 ℃下培養(yǎng)20 min。加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS，再繼續(xù)培養(yǎng)40 min。用1 mol·L-1Hepes溶液洗滌細(xì)胞3次，細(xì)胞重懸，制備成1×106個(gè)細(xì)胞/mL的單細(xì)胞混懸液。37 ℃下培養(yǎng)10 min，然后用美國BD Biosciences AccuriC6流式細(xì)胞儀進(jìn)行鈣離子熒光檢測(cè)。激發(fā)波長506 nm，發(fā)射波長526 nm。

2.7 Western blot法檢測(cè)Caspase-12蛋白水平

加藥培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用預(yù)冷的1×PBS洗滌兩次，加入100 μL混合好的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后10 000 r·min-1，4 ℃離心20 min，取25 μL上清液，BCA法蛋白定量，另一部分加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸滅活。12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳并恒流轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移到用無水甲醇活化的PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育目的蛋白抗體置于4 ℃冰箱過夜，TBST洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗2 h，ECL化學(xué)發(fā)光于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化的影響

通過油紅O染色，觀察SL提取物對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL后脂質(zhì)沉積的影響和比較提取部位的活性差異。與NC組比較，Model組和TM組油紅O染色陽性細(xì)胞遍布，細(xì)胞內(nèi)脂滴大而多，其IA值顯著增加(P<0.01，P<0.05)。與Model組比較，C組、SL組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少(P<0.01，P<0.01)；DS組和DZ組細(xì)胞內(nèi)脂滴無明顯變化(P>0.05，P>0.05)；但C組和SL組之間的藥效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示，SL整方能夠有效減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，抑制腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化，且與穿心蓮脂溶性提取部位藥效相同；而ERS可能進(jìn)一步增加巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇蓄積，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。結(jié)果見表1、圖1。

表1 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的影響

通過Annexin V-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。與NC組相比，Model組和TM組顯著誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞凋亡(P<0.01，P<0.01)；與Model組比較，DS組、DZ組、SL組均能顯著減少腹腔巨噬細(xì)胞凋亡(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；C組并未有效減少腹腔巨噬細(xì)胞凋亡(P>0.05)；其中SL組的藥效優(yōu)于DS組和DZ組(P<0.01，P<0.05)，但DS組和DZ組之間的藥效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示，SL整方能夠有效抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡，藥效優(yōu)于丹參各提取物部位；而ERS可引起巨噬細(xì)胞的凋亡。結(jié)果見圖2、表2。

圖1 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化的影響(400×)

圖2 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞凋亡的影響

表2 SL提取物及其提取部位對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞凋亡率的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01；DS組、DZ組與SL組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.3 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞Caspase-3活化的影響

細(xì)胞凋亡主要通過死亡受體介導(dǎo)的途徑和線粒體途徑共同調(diào)控Caspase-3來實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Caspase-3的活性，與NC組相比，Model組和TM組均能顯著上調(diào)Caspase-3的活性(P<0.01，P<0.01)。與Model組比較，DZ組、SL組均能降低Caspase-3的活性(P<0.01，P<0.05)；DS組和C組并未有效降低Caspase-3的活性(P>0.05，P>0.05)；其中DZ組的藥效優(yōu)于SL組(P<0.05)。提示，SL整方能夠有效降低Caspase-3的活性，抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡，丹參脂溶性提取部位藥效優(yōu)于整方；而ERS能增加Caspase-3的活性，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡。結(jié)果見表3。

表3 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞Caspase-3活性的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01；DZ組與SL組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.4 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加的影響

細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的直接體現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，進(jìn)一步研究SL對(duì)脂質(zhì)吞噬引起的巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響和比較提取部位的活性差異。與NC組相比，Model組和TM組均能提高腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平(P<0.05，P<0.05)。與Model組相比，DZ組、C組、SL組均能顯著降低腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；DS組并未有效降低腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平(P>0.05)；其中DZ組的藥效優(yōu)于SL組和C組(P<0.01，P<0.01)，但SL組和C組之間的藥效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示，SL整方能夠有效減少腹腔巨噬細(xì)胞中Ca2+水平，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且丹參脂溶性提取部位的藥效最優(yōu)；而ERS能促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加。結(jié)果見圖3、表4。

圖3 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加的影響

表4 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞鈣離子濃度增加的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01；DZ組與SL組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.5 SL提取物及其提取部位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞casepase-12活化的影響

Caspase-12是一種直接介導(dǎo)ERS誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的關(guān)鍵蛋白酶。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Caspase-12的活化程度，與NC組相比，Model組和TM組剪切型的Caspase-12蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.01，P<0.05)。與Model組相比，DS組、DZ組、SL組顯著降低剪切型的Caspase-12蛋白表達(dá)水平(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；C組并未有效降低剪切型的Caspase-12蛋白表達(dá)水平(P>0.05)；但DS組、DZ組與SL組之間的藥效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，P>0.05)。提示，SL整方能夠有效降低Caspase-12的活性程度，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞凋亡，且與丹參各提取部位的藥效相同；而ERS可上調(diào)Caspase-12的活化程度。結(jié)果見圖4、表5。

圖4 腹腔巨噬細(xì)胞casepase-12蛋白表達(dá)電泳

組別劑量/mg·L-1CleavedCaspase-12/β-actinNC00.45±0.14Model20.001.33±0.21##DS4.320.52±0.09??DZ2.500.69±0.22??C3.181.07±0.22SL10.000.78±0.10??TM1.000.60±0.32#

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

在As疾病發(fā)生發(fā)展過程中，同時(shí)存在著促炎和炎癥消散兩大調(diào)控體系，兩種進(jìn)程間彼此制約且相互轉(zhuǎn)化[1，16]。其中，主要由巨噬細(xì)胞胞葬作用(efferocytosis)介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物清除是炎癥消散過程的重要機(jī)制[17-18]。在生理狀態(tài)下，有效的胞葬作用可以保證脂質(zhì)過氧化物等炎癥原在動(dòng)脈內(nèi)膜等病灶內(nèi)的快速有效清除，能夠改變促炎機(jī)制的相對(duì)激活水平，重塑斑塊局灶的炎癥促-抑平衡，進(jìn)而保證斑塊局灶內(nèi)炎癥反應(yīng)在時(shí)空上的精確調(diào)控[19-20]。

在病理失衡狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞出現(xiàn)生存障礙，導(dǎo)致脂質(zhì)吞噬物的反復(fù)釋放和壞死細(xì)胞碎片的大量出現(xiàn)[21-22]。這一病理障礙極大地降低了脂質(zhì)過氧化炎癥原的清除效率，同時(shí)將會(huì)引發(fā)更為劇烈且持續(xù)的炎癥損傷，加速壞死核心和不穩(wěn)定斑塊的形成[18，23]。因此，ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的泡沫化和病理性死亡不僅僅是急性心血管事件發(fā)病的重要誘導(dǎo)因素，也是AS疾病進(jìn)展中炎癥失衡調(diào)控具有代表性的體現(xiàn)。綜上所述，巨噬細(xì)胞的清除效率和泡沫細(xì)胞的生存保護(hù)是從炎癥的源頭調(diào)控病理性炎癥損傷高強(qiáng)度、長時(shí)程進(jìn)行的關(guān)鍵要素，也形成了基于炎癥消散進(jìn)程的全新有效治療靶點(diǎn)。最新研究表明，通過減少巨噬細(xì)胞的凋亡，維持有效的胞葬作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的綜合治療具有明確而積極的意義。

本課題組對(duì)SL提取物具有較為深厚的研究積淀和較為系統(tǒng)的藥理學(xué)認(rèn)識(shí)。目前研究成果主要集中在：1)物質(zhì)組成和藥物安全性評(píng)價(jià)(SL提取物5～40 mg·L-1在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯細(xì)胞毒性[15])；2)對(duì)AS的干預(yù)活性和治療價(jià)值(SL提取物能夠減少AS斑塊面積，調(diào)節(jié)血脂，阻斷AS炎癥反應(yīng)[13-14])；3)基于抑制促炎反應(yīng)的抗AS藥理機(jī)制研究(SL提取物有效抑制NF-κB的活化，調(diào)節(jié)內(nèi)源性促炎介質(zhì)和炎癥消散介質(zhì)的再平衡而達(dá)到抑制AS炎癥的作用[14])。上述研究雖然對(duì)SL治療AS的主要藥效活性和通過抑制炎癥反應(yīng)治療AS的藥理機(jī)制較為清楚和明確，但SL對(duì)炎癥反應(yīng)平衡調(diào)控，特別是對(duì)炎癥消散反應(yīng)的調(diào)節(jié)活性仍尚未得到清楚的科學(xué)闡釋，同時(shí)對(duì)提取物中不同組分的活性比較和藥效貢獻(xiàn)度評(píng)價(jià)仍未涉及?；诖?，本實(shí)驗(yàn)的目的是以巨噬細(xì)胞泡沫化形成和泡沫細(xì)胞的凋亡為切入點(diǎn)，明確SL提取物全方對(duì)AS炎癥消散進(jìn)程的影響和對(duì)脂質(zhì)過氧化炎癥損傷平衡的重塑；評(píng)價(jià)和比較SL提取物不同提取組分藥效的貢獻(xiàn)度和活性差異，為SL提取物組方科學(xué)性和優(yōu)效性提供初步的研究提示和思路；揭示SL提取物在脂質(zhì)攝取過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)的藥理機(jī)制。

在上述AS治療的新思路和新靶點(diǎn)的指引下，本研究發(fā)現(xiàn)SL提取物整方可以顯著減少脂質(zhì)的積累。更為重要的是，我們?cè)跈C(jī)制水平首次創(chuàng)新提出SL提取物能夠通過對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控，改善巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后的生存障礙，減少泡沫細(xì)胞的凋亡，有效搭建起脂質(zhì)在斑塊內(nèi)動(dòng)態(tài)的代謝鏈條，提高了巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的清除效率。因此，本課題在巨噬細(xì)胞水平上，從炎癥原(脂質(zhì)過氧化物)和脂質(zhì)沉積形成脂質(zhì)壞死核心的整體角度，揭示了SL提取物促進(jìn)炎癥消散的藥效和作用機(jī)制。

同時(shí)，在對(duì)SL提取物進(jìn)行藥效藥理創(chuàng)新研究的基礎(chǔ)上，我們還通過比較各提取部位之間的活性差異，初步從炎癥消散和巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)攝取清除的角度，對(duì)SL提取物抗AS的成分基礎(chǔ)進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，在整方活性可靠穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，穿心蓮脂溶性提取物減少脂質(zhì)沉積的藥效優(yōu)于丹參各提取物部位；丹參脂溶性提取部位和丹參水溶性提取部位減少ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的藥效優(yōu)于穿心蓮脂溶性提取部位。上述各提取部位之間藥效的差異可能成為SL復(fù)方配伍科學(xué)性的重要論據(jù)，為后續(xù)SL提取物配方優(yōu)效性和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供初步的研究提示。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激TM組，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TM誘導(dǎo)的ERS可引起巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積、鈣離子濃度升高、Caspase-3活性增加、Caspase-12活化程度增加，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞凋亡。TM組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ox-LDL組誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡結(jié)果相符，進(jìn)一步提示SL提取物減少脂質(zhì)過氧化物誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與ERS有關(guān)。

未來研究中我們將著力在分子水平開展SL提取物調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號(hào)通路研究，論證其減少泡沫細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制。特別是針對(duì)穿心蓮脂溶性提取物減少脂質(zhì)沉積的情況，我們將依據(jù)脂質(zhì)炎癥原在動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)“攝取-轉(zhuǎn)化-流出”動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控的理論基礎(chǔ)，從巨噬細(xì)胞膽固醇攝取、酯化和外排的角度進(jìn)一步開展研究，探究其抑制泡沫細(xì)胞形成的具體作用機(jī)制。同時(shí)，我們還擬將進(jìn)一步圍繞“斑塊局灶內(nèi)脂質(zhì)代謝的完整鏈條”，從炎癥細(xì)胞遷出的角度，更加全面地揭示出SL提取物促進(jìn)脂質(zhì)過氧化病理性炎癥消散的活性特征。