鄧冬艷， 宋紅杰， 齊 悅

(四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，成都 610064)

0 引 言

氟他胺(FLA，2-甲基-N-[4-硝基-3-三氟甲基苯基]丙酰胺)為非甾體類雄激素拮抗劑。該藥物及其初級羥基代謝產(chǎn)物可通過第二性器官的靶細(xì)胞中的細(xì)胞色素P-450系統(tǒng)減少C-19甾體的代謝。能在細(xì)胞水平與雄激素競爭雄性激素受體，抑制雄激素依賴性的腫瘤細(xì)胞生長，進(jìn)而達(dá)到抑制前列腺癌生長的目的，能較好地緩解前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所帶來的疼痛[1-3]。目前，報道的氟他胺的分析方法包括分光光度法[4]、氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6-7]、電化學(xué)法[8-10]以及化學(xué)發(fā)光法[11]等。這些方法通常存在冗雜的樣品制備、繁瑣分析方法的構(gòu)建等缺點。而基于核磁共振波譜法分析研究氟他胺尚未見報導(dǎo)。目前核磁共振技術(shù)已經(jīng)被納入中國藥典，廣泛用于藥品含量的定量分析。由于氟他胺含有氟原子，設(shè)想利用靈敏度高的核磁共振氟譜法(19F NMR)對氟他胺進(jìn)行定性與定量分析。

核磁共振檢測不破壞樣品結(jié)構(gòu)，能夠保持體系的完整。而核磁共振氟譜測試無需使用氘代試劑，可以在任何溶液體系下進(jìn)行檢測。由于含氟化學(xué)藥品的不斷增加，定性用核磁共振氟譜日益受到關(guān)注，但是19F NMR定量技術(shù)用于含氟化學(xué)藥品含量測定的研究還很少[12-15]。從天然豐度等方面考慮，核磁共振氟譜的檢測靈敏度和氫譜相當(dāng)(≈0.83倍)[13]，其測試時間及樣品濃度均遠(yuǎn)小于13C、15N與31P譜。但是相比于核磁共振氫譜，氟譜具有更寬的化學(xué)位移范圍，信號峰重疊少，易于分辨并進(jìn)行峰強(qiáng)度的比較。同時，常見含氟化學(xué)藥品中大多數(shù)只含有1種或2種不同化學(xué)環(huán)境的氟原子，使得19F NMR譜復(fù)雜程度遠(yuǎn)小于1H NMR譜。由此，利用19F NMR定量技術(shù)進(jìn)行含氟化學(xué)藥品的含量測定具有顯著優(yōu)勢，可為準(zhǔn)確測定該類藥品的含量提供一種快速、準(zhǔn)確且干擾較小的研究方法。

本文設(shè)計了利用核磁共振氟譜技術(shù)測定氟他胺含量的實驗。實驗通過設(shè)定適宜的測試參數(shù)，選取三氟甲苯為內(nèi)標(biāo)物，利用化學(xué)位移標(biāo)定歸屬，進(jìn)一步由特征峰的相對積分值進(jìn)行定量分析。該實驗方法簡單，重復(fù)性好，易于實現(xiàn)。

1 實 驗

1.1 主要試劑、材料與儀器

試劑與材料：本實驗中所用全部試劑均為分析純及以上。氘代氯仿購自青島騰龍微波科技有限公司，氟他胺及三氟甲苯(1.188 6 g/mL)購于阿拉丁試劑公司。

試驗儀器：核磁共振波譜儀(AVANCE III HD, 400 MHz, Bruker, Germany)。儀器相關(guān)信息，1H 400.13 MHz；19F 376.47 MHz。

1.2 樣品制備

1.2.1 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制

吸取0.10 mL三氟甲苯至9.90 mL 氘代氯仿配成11.886 mg/mL的儲備液待用。

1.2.2 氟他胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品至氘代氯仿配制濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.05 mL內(nèi)標(biāo)物溶液，然后移至核磁管內(nèi)。

1.3 檢測方法

1.3.11H NMR測定

氫譜分析條件：測定溫度25 °C；檢測頻率400.13 MHz；譜寬7 211.54 Hz；脈沖寬度12.0 μs；采集時間4.54 s；延遲時間1.0 s；增益值80.6；采集100次。

對配制好的氟他胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行核磁氫譜測定，設(shè)置參數(shù)后做1H NMR譜圖。吸收峰準(zhǔn)確定標(biāo)，調(diào)整峰相位，使峰形左右對稱，調(diào)整基線。

1.3.219F NMR測定

氟譜分析條件：測定溫度25 °C；檢測頻率376.47 MHz；譜寬5 647.59 Hz；脈沖寬度13.5 μs；采集時間11.6 s；延遲時間1.0 s；增益值203；采集64次。

對配制好的氟他胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行核磁氟譜測定。設(shè)置參數(shù)后做19F NMR譜圖。吸收峰準(zhǔn)確定標(biāo)，調(diào)整峰相位，使峰形左右對稱，調(diào)整基線。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及重復(fù)性實驗的測定

將配制好的濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的氟他胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入50 μL三氟甲苯內(nèi)標(biāo)物溶液，進(jìn)行19F NMR測定。對氟他胺和三氟甲苯內(nèi)標(biāo)物的特征峰進(jìn)行積分，標(biāo)識為S1和S2。然后以樣品積分面積與內(nèi)標(biāo)物的積分面積比S1/S2為縱坐標(biāo)，以樣品的濃度與內(nèi)標(biāo)物的濃度比C1/C2為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取上述同一氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液放入核磁管進(jìn)行氟譜掃描，按照1.3.2的操作方法連續(xù)測定5次，每次譜圖反復(fù)積分3次，記錄氟他胺定量峰與三氟甲苯內(nèi)標(biāo)峰積分面積比值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氟他胺核磁共振氫譜分析

測定氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品1H NMR，結(jié)果如圖1所示。標(biāo)定氘代氯仿的殘余溶劑峰δ為7.26×10-6，可得氟他胺氫譜信號峰主要出現(xiàn)在(1.0～8.5)×10-6之間，各信號峰的歸屬分析結(jié)果表明其符合化合物結(jié)構(gòu)。

圖1 氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品在氘代氯仿中的1H NMR譜圖

2.2 內(nèi)標(biāo)物和定量峰的選擇

根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的選擇要求[13]，擬選取的三氟甲苯具有較高的純度，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；與被測物質(zhì)氟他胺的化學(xué)性質(zhì)相近，不與樣品中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。

由圖2可知，內(nèi)標(biāo)物的特征峰與被測物的特征峰完全分離，不存在干擾；對不同的物質(zhì)峰進(jìn)行歸屬，在化學(xué)位移δ=-61.10×10-6和δ=-63.72×10-6出現(xiàn)兩個較大的尖銳峰，且無其他雜峰干擾。因此，三氟甲苯可選作內(nèi)標(biāo)物。同時，三氟甲苯分子只含有一種氟原子，根據(jù)圖2內(nèi)插圖可得，δ=-63.72×10-6處信號為三氟甲苯的特征峰，則δ=-61.10×10-6處為氟他胺的特征峰，該峰峰形尖銳，易于積分用于定量分析，故選作定量峰。本工作選擇氘代氯仿作為溶劑，能夠很好地溶解氟他胺和三氟甲苯，且氘代氯仿不含氟，亦不會干擾內(nèi)標(biāo)物和分析物的譜峰。內(nèi)標(biāo)物及分析物的19F NMR譜見圖2。

圖2 氟他胺與三氟甲苯在氘代氯仿中的19F NMR譜(注: a為氟他胺，b為三氟甲苯；內(nèi)插為三氟甲苯在氘代氯仿中的19F NMR譜)

2.3 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確配制濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的氟他胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入50 μL內(nèi)標(biāo)物溶液，測試19F NMR譜圖，結(jié)果如圖3所示。

圖3 核磁共振氟譜測定氟他胺的積分面積與濃度線性關(guān)系

結(jié)果表明，氟他胺濃度為0.2～10.0 mg/mL時，S1/S2與C1/C2呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.574x-0.053，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。表明以三氟甲苯為內(nèi)標(biāo)物，核磁共振氟譜法用于氟他胺的定量測定線性關(guān)系良好，該方法是可行的。

2.4 定量限與檢出限

采用設(shè)定的氟譜測試條件，本實驗以信噪比S/N>10作為定量限的標(biāo)準(zhǔn)，以S/N>3作為檢出限的標(biāo)準(zhǔn)。由此，計算得到氟他胺的定量限為18 μg/mL，檢出限為50 μg/mL。而線性關(guān)系曲線中氟他胺溶液的最低濃度為0.2 mg/mL，滿足定量限的要求。

2.5 重復(fù)性實驗

取上述同一氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2.0 mg/mL)放入核磁管進(jìn)行氟譜掃描，按照1.3.2的操作方法連續(xù)測定5次，每次譜圖反復(fù)積分3次，記錄氟他胺定量峰與三氟甲苯內(nèi)標(biāo)峰積分面積比值。所得的RSD為1.94%。表明該方法的精密度良好，實驗結(jié)果見表1。

表1 氟他胺精密度實驗結(jié)果

3 結(jié) 語

本實驗以三氟甲苯為內(nèi)標(biāo)物，利用化學(xué)位移標(biāo)定歸屬，進(jìn)一步由相對積分值進(jìn)行定量分析。利用核磁共振技術(shù)，以化學(xué)位移δ=-61.10×10-6處的氟他胺的單峰作為定量峰，得到其峰面積比與其濃度比線性回歸方程為y=0.574x-0.053，線性關(guān)系良好，實現(xiàn)了氟他胺的核磁共振的準(zhǔn)確含量測定。該實驗設(shè)計不僅拓展了19F核磁共振定量方法在含氟藥物含量測定中的應(yīng)用，而且有效加強(qiáng)了學(xué)生對核磁共振定量分析方法的理解及相應(yīng)科學(xué)實驗的思維方式和創(chuàng)新能力。