江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮陰師范學(xué)院)，江蘇 淮安 223300 江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001 江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)科技實(shí)業(yè)總公司，江蘇 淮安 223001 (江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001)

甘薯腐爛莖線蟲(chóng)病是我國(guó)農(nóng)業(yè)上的重要病害，在國(guó)內(nèi)主要分布于河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇等省份。其病原甘薯腐爛莖線蟲(chóng)(Ditylenchusdestructor)最早在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)，可導(dǎo)致馬鈴薯腐爛[1]。近年來(lái)通過(guò)掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，確定侵染我國(guó)甘薯的莖線蟲(chóng)屬于甘薯腐爛莖線蟲(chóng)[2，3]，同時(shí)通過(guò)對(duì)該線蟲(chóng)核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(rDNA-ITS區(qū))核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，我國(guó)甘薯腐爛線蟲(chóng)很可能包含2 個(gè)獨(dú)立種。宛菲等[4]研究了21 個(gè)國(guó)內(nèi)甘薯腐爛莖線蟲(chóng)種群，發(fā)現(xiàn)其rDNA-ITS區(qū)存在特異性差異，分別命名為A型和B型；黃建等[5]對(duì)所研究的線蟲(chóng)種群進(jìn)行了ITS區(qū)序列分析及形態(tài)測(cè)量，同樣認(rèn)為我國(guó)甘薯腐爛莖線蟲(chóng)分為2個(gè)基因型。為了弄清不同遺傳背景腐爛莖線蟲(chóng)群體間是否能夠進(jìn)行生物學(xué)雜交以及是否有生殖隔離的現(xiàn)象存在，對(duì)不同遺傳背景的線蟲(chóng)種群生物學(xué)雜交體系進(jìn)行了構(gòu)建與驗(yàn)證，并獲得了最佳方案。

1 材料與方法

1.1 線蟲(chóng)種群

供試腐爛莖線蟲(chóng)群體分別來(lái)自山東沂水的DeLY群體和河南洛陽(yáng)的DeYL群體。雜交組合分正反交，分別為 DeLY×DeYL和DeYL×DeLY；所用薯塊品種為蘇渝303。

1.2 幼蟲(chóng)及雄蟲(chóng)的準(zhǔn)備

在40×體式顯微鏡下用線蟲(chóng)針挑取各線蟲(chóng)種群幼蟲(chóng)放在玻片上，并轉(zhuǎn)到100×顯微鏡下進(jìn)一步確認(rèn)無(wú)誤后(未見(jiàn)生殖器分化)，收集到凹面皿中備用。雄蟲(chóng)則在40×體式顯微鏡下直接挑出。

1.3 生物學(xué)雜交試驗(yàn)

1)薯片平板雜交法 接種到薯片上，接種薯片以瓊脂糖凝膠平板法置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)20次，接種1個(gè)月后將實(shí)驗(yàn)材料挑至計(jì)數(shù)皿中，滴無(wú)菌水進(jìn)行線蟲(chóng)分離并在顯微鏡下觀察有無(wú)后代產(chǎn)生。

2)薯?xiàng)l離心管雜交法 在離心管里注入20μL無(wú)菌水后將線蟲(chóng)挑入其中，將打孔器打下的薯?xiàng)l用滅菌刀切下后置于離心管內(nèi)，放置于平板里在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，重復(fù)20次，接種1個(gè)月后將實(shí)驗(yàn)材料挑至計(jì)數(shù)皿中，滴無(wú)菌水進(jìn)行線蟲(chóng)分離并在顯微鏡下觀察有無(wú)后代產(chǎn)生。

3)薯塊切片打孔雜交法 將薯塊縱向切去1/3，留下的部分用打孔器打孔，孔間距約3cm，在接入線蟲(chóng)之前，先在每個(gè)孔里注入少許無(wú)菌水，以不溢出小孔為準(zhǔn)。將線蟲(chóng)接到小孔內(nèi)(注入無(wú)菌水的目的在于接種線蟲(chóng)時(shí)，便于線蟲(chóng)由挑針游離到無(wú)菌水里，而不至于挑針碰到薯塊而將線蟲(chóng)擠壓死)，之后將切下的部分薯塊作為天然保濕蓋蓋在處理過(guò)的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，用皮筋捆綁后平放在培養(yǎng)箱里。在儲(chǔ)藏盒內(nèi)預(yù)先噴施少量無(wú)菌水，以保持薯塊濕潤(rùn)的生長(zhǎng)環(huán)境，以利于線蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。

以上雜交方法如圖1所示，將某線蟲(chóng)種群的1 條幼蟲(chóng)與另一種群的2 條雄蟲(chóng)用線蟲(chóng)針接入打好洞的薯塊中，接入線蟲(chóng)后用石蠟封口，同時(shí)做反交組合，25℃培養(yǎng)30d后觀察結(jié)果。雜交的每個(gè)組合重復(fù)20 次。將每次處理置于計(jì)數(shù)皿中分離觀察。

圖1 腐爛莖線蟲(chóng)不同雜交方案圖示

1.4 線蟲(chóng)DNA的提取

DNA提取方法參照Wang等[6]的方法進(jìn)行。用挑針挑取線蟲(chóng)若干條，放入去離子水中洗滌3次，備用。在潔凈的載玻片上加8μL去離子水，挑入1 條洗過(guò)的線蟲(chóng)，用解剖刀將線蟲(chóng)切成2～3段，用移液槍轉(zhuǎn)入到200μL PCR反應(yīng)管中；然后分別加入1μL PCR緩沖液(10×PCR Buffer)和1μL蛋白酶K(1mg/mL)，混勻；-20℃冷凍過(guò)夜之后，65℃保溫1h，94℃滅活10min，輕度離心后上清液可直接用于PCR擴(kuò)增。

1.5 雜交后代的分子鑒定1.5.1 ITS區(qū)域的PCR擴(kuò)增

反應(yīng)總體積50μL：ddH2O 28.6μL，10×PCR Buffer (Mg2+)5μL，dNTP (2.5mmol/L) 2μL，上游引物 (10μmol/L) 3μL，下游引物 (10μmol/L) 3μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，模板DNA 8μL。反應(yīng)條件：95℃ 3min； 95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min，使反應(yīng)物充分延伸。反應(yīng)結(jié)束后即可開(kāi)始電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。研究采用線蟲(chóng)ITS區(qū)通用引物[7,8]：P1：5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’; P2：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’。引物由上海寶生物公司合成。

1.5.2 雜交后代RFLP酶切

酶切參照WenDt等[9]的方法進(jìn)行。所用3 種內(nèi)切酶為RsaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ。酶切反應(yīng)在200μL PCR反應(yīng)管中進(jìn)行。酶切體系10μL：PCR反應(yīng)產(chǎn)物 7μL，內(nèi)切酶(10U/μL)1μL，與內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)的Buffer 1μL、ddH2O 1μL。酶切反應(yīng)條件為37℃、3h。在2.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EB染色觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，應(yīng)用DPS統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算平均數(shù)并進(jìn)行差異的顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛莖線蟲(chóng)不同雜交方案雜交結(jié)果

DeLY(群體A)種群與DeYL(群體B)種群雜交結(jié)果詳見(jiàn)表1。在正反交組合中，其中“DeLY×DeYL”正交組合能產(chǎn)生F1代，而反交則不成功。3種體系中正交組合的雜交率分別為30%、20%和30%，均低于對(duì)照組DeYL×DeYL雜交率，而3個(gè)正交組合所產(chǎn)生的F1代數(shù)量分別為6.17、8.25條和14.33條，與對(duì)照親本后代數(shù)相比顯著降低，均在P<0.05水平上差異顯著，表現(xiàn)出不同遺傳背景線蟲(chóng)雜交親和力差，F(xiàn)1代線蟲(chóng)數(shù)量少。3種雜交方案均可以培養(yǎng)成功，不同的是甘薯切片接種法雜交率高，后代數(shù)量多，親本自交數(shù)量與其他2種方法相比差異顯著，同時(shí)甘薯切片法微環(huán)境更接近原始寄主狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力，相比甘薯平板打孔法和薯?xiàng)l離心管雜交法，更便于線蟲(chóng)在小孔內(nèi)集中，增加線蟲(chóng)雜交幾率。

表1 腐爛莖線蟲(chóng)不同雜交方案雜交結(jié)果

注：雜交組合中帶“*”的為對(duì)照組，同列數(shù)據(jù)后不同肩標(biāo)字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

2.2 雜交后代的ITS-PCR-RFLP分析

對(duì)“DeLY×DeYL”雜交組合產(chǎn)生的F1代進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2(a))， “DeLY×DeYL”正交組合產(chǎn)生的F1代中ITS擴(kuò)增產(chǎn)物非特異，有雜帶出現(xiàn)，主帶約為800bp，主帶與母本較為一致。推測(cè)可能在雜交F1有不同類型遺傳分化的個(gè)體出現(xiàn)。

(a)親本與雜交后代ITS產(chǎn)物分析；泳道：1：DeLY為父本(群體A),2：DeLY×DeYL(F1代),3：DeYL為母本(群體B)。(b)～(d)分別代表父本、雜交代、母本經(jīng)Rsa Ⅰ、 Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ 3種酶酶切后的產(chǎn)物；(b)～(d)1～3的泳道代表為：1：DeLY(父本)；2：(DeLY×DeYL)F1代；3：DeYL(母本)圖2 親本與雜交后代ITS-PCR-RFLP圖譜

2.3 雜交后代ITS區(qū)限制性酶切

從圖2(b～d)ITS-RFLP分析結(jié)果顯示DeLY×DeYL的正交組合產(chǎn)生的F1代酶切片段長(zhǎng)度在RsaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ 3個(gè)酶切位點(diǎn)上與親本存在明顯差異。F1代經(jīng)過(guò)RsaⅠ酶切后出現(xiàn)主帶為750bp，HaeⅢ酶切后出現(xiàn)主帶約為600bp，HinfⅠ酶切后出現(xiàn)主帶約為450bp，均不同于父本和母本，這一結(jié)論說(shuō)明2個(gè)不同遺傳背景的種群在雜交代遺傳圖譜表現(xiàn)不同，同時(shí)也證實(shí)了雜交方案與體系構(gòu)建是成功的，酶切片段差異詳見(jiàn)圖2。

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)關(guān)于腐爛莖線蟲(chóng)研究報(bào)道較多，主要集中在致病力、耐寒力、侵染途徑、種群發(fā)生危害動(dòng)態(tài)及分類與防治等方面[10～12]，關(guān)于生物學(xué)雜交體系方案鮮有報(bào)道。研究比較了腐爛莖線蟲(chóng)不同雜交體系的優(yōu)缺點(diǎn)并篩選了最佳的雜交方案以進(jìn)行腐爛莖線蟲(chóng)的雜交學(xué)研究，建立了以“甘薯切片打孔法”為主要生物學(xué)雜交體系，該體系優(yōu)勢(shì)在于線蟲(chóng)容易集中收集、薯塊密封好便于線蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)，分子鑒定結(jié)果表明，不同遺傳背景腐爛莖線蟲(chóng)的雜交后代 “DeLY×DeYL”組合表現(xiàn)出異質(zhì)性，驗(yàn)證了所構(gòu)建的雜交體系是成功的。該研究揭示了不同地理來(lái)源的具有不同遺傳背景的腐爛莖線蟲(chóng)群體間雜交在后代遺傳背景上表現(xiàn)異質(zhì)性，為今后不同遺傳背景線蟲(chóng)間進(jìn)行生物學(xué)雜交提供參考依據(jù)，并可為不同遺傳背景線蟲(chóng)的生殖隔離研究和其他進(jìn)境檢疫性線蟲(chóng)的生物學(xué)雜交提供參考。