李江 夏鵬 曹必偉 徐建果

摘要：目的 ?篩選獨(dú)活對巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）抑制作用的有效成分，為獨(dú)活治療炎癥和免疫介導(dǎo)疾病的作用機(jī)制研究及MIF抑制劑研發(fā)提供參考。方法 ?以中國臺灣中醫(yī)藥資料庫中獨(dú)活有效成分小分子化合物為對接配體庫、MIF晶體結(jié)構(gòu)為對接受體進(jìn)行分子對接，篩選結(jié)合能高于原配體的小分子。對結(jié)合后的復(fù)合物構(gòu)像進(jìn)行相互作用分析，選取最佳配體小分子與大分子復(fù)合物進(jìn)行10 ns的動力學(xué)模擬，分析均方根偏差（RMSD）值。操作平臺為Linux系統(tǒng)，采用OpenBabelGUI2.4.1進(jìn)行小分子修飾，Pyrx0.8進(jìn)行虛擬篩選，NAMD2.13進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，VMD1.9.3、Discovery studio4.5及Ligplot+1.4.5進(jìn)行對接結(jié)果及動力學(xué)模擬結(jié)果分析。結(jié)果 ?篩選出優(yōu)于原配體的獨(dú)活有效成分4種，分子相互作用分析提示主要作用殘基8個，主要作用力為氫鍵及疏水作用，動力學(xué)模擬結(jié)果表明最佳配體小分子與受體結(jié)合較穩(wěn)定。結(jié)論 ?本研究提示獨(dú)活抗炎作用機(jī)理可能與抑制MIF活性有關(guān)，其抑制作用有效成分主要有4種，可為研究和設(shè)計(jì)MIF抑制劑提供參考。

關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞遷移抑制因子;獨(dú)活;抑制劑;虛擬篩選;分子動力學(xué)模擬

中圖分類號：R2-05;R285 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0105-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.022 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To screen the active components of Angelicae Pubescentis Radix for inhibiting MIF; To provide references for the study on the mechanism of inflammatory and immune-mediated diseases and the development of MIF inhibitors. Methods Using the small molecule compound of the active components in the TCM database of Taiwan as a docking ligand library， the MIF crystal structure was the acceptor for molecular docking， and small molecules with higher binding energy than the original ligand were screened. The interaction analysis of the combined complex conformation was carried out， and the optimal ligand small molecule and macromolecular complex were selected for 10 ns kinetic simulation to analyze the root mean square deviation （RMSD） value. The operating platform was Linux system. OpenBabelGUI2.4.1 was used for small molecule modification， Pyrx0.8 for virtual screening， NAMD2.13 for molecular dynamics simulation， VMD1.9.3， Discovery studio4.5 and Ligplot+1.4.5 for docking results and dynamics simulation results analysis. Results Four active components were screened out， which were superior to the original ligand. Molecular interaction analysis indicated that there were 8 main action residues， and main force was hydrogen bonding and hydrophobic interaction. Kinetic simulation results showed that the binding of small molecules of the best ligand to the receptor was stable. Conclusion It is indicated that the anti-inflammatory mechanism of Angelicae Pubescentis Radix may be related to the inhibition of MIF activity. There are four main active components of Angelicae Pubescentis Radix， which can provide references for the study and design of MIF inhibitors.

Keywords： MIF; Angelicae Pubescentis Radix; inhibitors; virtual screening; molecular dynamics simulation

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一類多效性的前炎癥因子，能激活轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)其他各類前炎癥因子的表達(dá)，同時，能直接刺激固有細(xì)胞內(nèi)前炎癥因子庫的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，并創(chuàng)造以前炎癥因子為主的炎性微環(huán)境[1]。MIF與許多炎癥和免疫介導(dǎo)的疾病有關(guān)，如全身性血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）等。臨床研究表明，MIF與RA發(fā)病密切相關(guān)，其抑制結(jié)合位點(diǎn)是非常有希望的藥物作用靶點(diǎn)[2]。MIF晶體結(jié)構(gòu)最早于1996年被Sun等解析[3]，為由3個相同亞基組成的桶狀結(jié)構(gòu)的三聚體，催化活性中心位于相鄰亞基之間。

RA是以慢性、對稱性多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的疾病。目前西醫(yī)治療尚無特效方法，且長期服藥不良反應(yīng)較大。中醫(yī)藥在防治RA方面療效較好[4]。但中藥有效成分較為復(fù)雜，藥物作用機(jī)制難以闡明。隨著生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等學(xué)科的發(fā)展，藥物與靶標(biāo)作用機(jī)制能以更直觀的方式呈現(xiàn)。獨(dú)活是重要的祛風(fēng)濕藥，《本草匯言》載“獨(dú)活，善行血分，祛風(fēng)行濕散寒之藥也”。本研究使用小分子虛擬篩選與分子動力學(xué)模擬等技術(shù)探索獨(dú)活中MIF抑制劑小分子，以探究獨(dú)活治療RA等疾病的作用機(jī)理。

1 ?資料與方法

1.1 ?操作平臺與軟件

操作平臺為Linux系統(tǒng)，采用OpenBabelGUI2.4.1進(jìn)行小分子修飾，Pyrx0.8進(jìn)行虛擬篩選，NAMD2.13進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，VMD1.9.3、Discovery studio4.5及Ligplot+1.4.5進(jìn)行對接結(jié)果及動力學(xué)模擬結(jié)果分析。

1.2 ?獨(dú)活小分子數(shù)據(jù)庫建立

獨(dú)活小分子數(shù)據(jù)來源于中國臺灣中醫(yī)藥資料庫TCM Database@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/ index.php）。該數(shù)據(jù)庫是目前全世界最大的可直接用于虛擬篩選和分子動力學(xué)模擬的中醫(yī)藥小分子數(shù)據(jù)庫，含中藥443種、中藥小分子化合物2萬多種。該數(shù)據(jù)庫可提供中藥成分查詢，或已知某種成分，查詢含有該成分的中藥。進(jìn)階查詢提供以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的查詢，使用者可在線畫出要查詢的主結(jié)構(gòu)，再輸入限制條件，如分子量、分子體積、Log P、氫鍵接受體數(shù)目等，進(jìn)行復(fù)合式查詢[5]。

建立獨(dú)活小分子數(shù)據(jù)庫。下載獨(dú)活有效成分小分子mol2文件后使用OpenBabelGUI2.4.1軟件將其轉(zhuǎn)換為sdf文件等待對接。

1.3 ?受體蛋白數(shù)據(jù)建立

從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫搜索MIF蛋白結(jié)構(gòu)信息，選擇人源型、鑒定方法為X射線衍射法、分辨率>2.6 ?的結(jié)構(gòu)。最終確定PDB ID為1LJT的蛋白晶體結(jié)構(gòu)為對接受體蛋白。該蛋白結(jié)構(gòu)含MIF蛋白與3個配體小分子，每個配體小分子鑲嵌在2個亞基之間。使用Discovery studio軟件將蛋白與配體小分子分離后另存為單獨(dú)pdb文件，然后計(jì)算小分子的結(jié)構(gòu)中心數(shù)據(jù)并保存。使用Pyrx軟件導(dǎo)入分離后的受體與配體結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)存為對接文件，設(shè)置對接中心為配體中心，對接半徑為5?，Exhaustion參數(shù)設(shè)為8，運(yùn)行Autodock Vina對接模塊。對接結(jié)束后選擇Binding Affinity第一的結(jié)果并使用VMD計(jì)算該結(jié)果與原配體的均方根偏差（RMSD）值，得出RMSD=1.14 ?，提示原配體可較好地還原到對接口袋中，設(shè)置的對接參數(shù)合理[6]。

1.4 ?獨(dú)活小分子成分虛擬篩選

將收集到的獨(dú)活小分子導(dǎo)入Pyrx并進(jìn)行能量優(yōu)化，然后保存為對接小分子。再次使用Vina程序?qū)ㄔ潴w小分子在內(nèi)的所有小分子與MIF大分子受體進(jìn)行對接，其中原配體作為陽性對照小分子，對接參數(shù)為原參數(shù)。對接結(jié)束后按Binding Affinity能量值由低到高排序，選取能量低于原配體的小分子并單獨(dú)保存為pdb文件。將得到的小分子分別還原到結(jié)合口袋中，分別使用Discovery studio軟件和Ligplot+[7]軟件分析小分子與受體相互作用關(guān)系三維與二維構(gòu)像圖，并分析主要作用殘基和作用力。

1.5 ?分子動力學(xué)模擬

使用NAMD[8]對對接能量最低的小分子與受體的復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行10 ns分子動力學(xué)模擬，觀察復(fù)合物的穩(wěn)定性。首先分析小分子結(jié)構(gòu)并編寫相應(yīng)的拓?fù)湮募c力場參數(shù)文件，再將復(fù)合物加入立方體水盒子中，同時加入平衡離子使整體電荷為中性，平衡離子為NaCl，并生成psf文件。浸入水盒子的復(fù)合物模型構(gòu)建完成后先進(jìn)行1000步（Timestep）的能量優(yōu)化，然后再進(jìn)行動力學(xué)模擬。模擬中使用的力場主要為CHARMM力場，時間步長設(shè)置為2 fs，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，模擬結(jié)束后分析RMSD值。

2 ?結(jié)果

2.1 ?分子對接結(jié)果

本研究從數(shù)據(jù)庫下載獨(dú)活有效成分小分子84個，對接結(jié)束后得到結(jié)合能低于原配體的小分子4個，其結(jié)合能與結(jié)構(gòu)信息見表1。結(jié)果顯示原配體結(jié)合能為-8.3 kcal/mol，高于其結(jié)合能的4個小分子共有7種結(jié)合構(gòu)像，其中排名第二的小分子（Z）-3-（6-Hydroxy- 1-benzofuran-5-yl）acrylaldehyde共有4種。而親和力最高的為（Z）-3-[（R）-6-Hydroxy-2-isopropyl-2，3-dihydro- 1-benzofuran-5-yl]acrylaldehyde小分子，其結(jié)合能為-9.4 kcal/mol。

2.2 ?相互作用分析

排名第二的小分子有4種構(gòu)像，僅顯示結(jié)合能較小的構(gòu)像。小分子在受體蛋白中結(jié)合位點(diǎn)見圖1?？梢钥闯觯?個小分子均鑲嵌到了MIF蛋白2個亞基之間的連接處，結(jié)合較緊密。

小分子與蛋白作用殘基三維與二維結(jié)構(gòu)見圖2、圖3。相互作用殘基表明，產(chǎn)生疏水作用殘基主要為TYR36、TYR95、PHE113、VAL106、MET101、ILE64、LYS32、PRO1，正靜電勢主要在LYS32殘基附近。序號1小分子與ILE64上的N原子和LYS32上的NZ原子形成氫鍵，鍵長分別為3.10 ?和2.92 ?。序號2小分子與LYS32上的NZ原子形成氫鍵，鍵長為2.92 ?。氫鍵是維系蛋白質(zhì)與配體分子穩(wěn)定性的重要作用力，一般氫鍵的鍵能為2～8 kcal/mol，不同原子的鍵能不同。提示序號1與序號2的結(jié)合能差別主要在于氫鍵。

2.3 ?分子動力學(xué)模擬

能量優(yōu)化結(jié)果見圖4，在1500 fs時能量基本達(dá)最低值，提示能量優(yōu)化較徹底，優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)可進(jìn)行動力學(xué)模擬。

復(fù)合物RMSD值波動圖見圖5，其均值為（1.53±0.18）?。約5 ns后整個復(fù)合物趨于穩(wěn)定，無較大波動，提示小分子與MIF結(jié)合后較穩(wěn)定。

3 ?結(jié)論

本研究使用藥物虛擬篩選技術(shù)對單味中藥獨(dú)活小分子化合物進(jìn)行虛擬篩選，最后得到4種優(yōu)于原MIF晶體結(jié)構(gòu)中配體的小分子化合物，對接后的小分子均鑲嵌在MIF 2個相鄰亞基間的活性口袋中。分子相互作用分析結(jié)果表明，主要的結(jié)合作用力為氫鍵和疏水作用，主要作用殘基有8個。對篩選出來的最佳小分子與受體結(jié)合后的模型進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)受體與配體能穩(wěn)定結(jié)合，提示獨(dú)活基于MIF抑制劑的有效抗炎活性成分可能為（Z）-3-[（R）-6-Hydroxy-2- isopropyl-2，3-dihydro-1-benzofuran-5-yl]acrylaldehyde小分子。本研究探索了獨(dú)活在抑制MIF活性中的作用機(jī)理，可為進(jìn)一步闡釋獨(dú)活治療炎癥和免疫介導(dǎo)疾病的作用機(jī)制研究及設(shè)計(jì)研發(fā)MIF抑制劑提供參考。

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（收稿日期：2018-11-03）

（修回日期：2018-11-22;編輯：向宇雁）