張懷波，馬榮龍，張德景

（河南省濮陽市油田總醫(yī)院 普外三科，河南 濮陽 457001）

原發(fā)性肝癌是指發(fā)生于肝細胞內(nèi)或者肝內(nèi)膽管細胞的癌癥，是我國常見的惡性腫瘤之一，病死率居全國惡性腫瘤第二位，其中絕大多數(shù)為肝細胞癌。治療困難，極易復發(fā)[1-2]。Clara細胞分泌蛋白10（CC10）又名子宮珠蛋白，由固醇誘導產(chǎn)生，隸屬分泌珠蛋白家族，具有多種生理功能，在抗炎和免疫調(diào)節(jié)等生理活動中發(fā)揮重要的作用[3-4]。CC10主要在與外部環(huán)境直接相通的人體器官上皮細胞中表達，包括鼻、舌下腺、支氣管、肺和乳腺等[3，5-6]。研究表明，CC10是炎癥和過敏反應的重要介質(zhì)，是呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤的早期標志物[7]。目前對CC10的研究多集中在乳腺及呼吸系統(tǒng)，在肝癌細胞中尚未見研究報道。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是細胞周期素家族的關鍵成員之一，通過調(diào)節(jié)G1期正向調(diào)控細胞周期進展[8]。Cyclin D1的過表達可導致增殖失控，引發(fā)細胞癌變。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1過表達可能是肝癌發(fā)生的早期標志，在腫瘤分化中起重要作用，對肝癌的診斷及患者預后有重要的意義[9]。本研究用含CC10基因的重組質(zhì)粒轉染肝癌細胞HepG2，檢測外源性CC10對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響以及對Cyclin D1表達的影響，初步探索CC10對肝癌的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常肝細胞LO2和肝癌細胞HepG2、Hep3B購自ATCC公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自GIBCO公司；胎牛血清購自浙江四季青生物科技有限公司；青霉素、鏈霉素、總蛋白提取試劑盒、胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；轉染試劑LipofectionTM購自InivoGene公司；pcDNA 3.1空載體質(zhì)粒和反轉錄試劑盒購自Thermo公司；SYBR Premix Ex TaqTMII購自Takara公司；pcDNA 3.1-CC10質(zhì)粒由本實驗室構建并保存；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；引物由北京六合華大基因科技有限公司合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒、一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和HRP標記山羊抗兔抗體購自碧云天生物技術公司；鼠抗人CC10多抗、GAPDH單抗和HRP標記山羊抗鼠抗體購于Santa Cruz公司；兔抗大鼠Cyclin D1抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；Transwell小室購自Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染

細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中（10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素），培養(yǎng)箱設置成以下參數(shù)：37 ℃、5% CO2。每隔1～2 d傳代1次，選對數(shù)生長期細胞進行試驗。

將對數(shù)期、生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，接種于含RPMI 1640培養(yǎng)液的六孔板上（每孔2×105個細胞），于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞密度為90%左右時，按照LipofectionTM說明書提示的操作步驟分別用4 μg pcDNA3.1空載體質(zhì)粒（記為pcDNA 3.1組）和4 μg pcDNA 3.1-CC10質(zhì)粒（記為pcDNA 3.1-CC10組）轉染細胞，每個處理設置3個復孔。

1.3 細胞中CC10和Cyclin D1的表達檢測

用TRIzol試劑提取人正常肝細胞LO2和肝癌細胞HepG2、Hep3B以及pcDNA 3.1組和pcDNA 3.1-CC10組（轉染48 h）細胞總RNA，取1 μg RNA作為模板反轉錄合成cDNA。以此為模板進行qPCR反應。以GAPDH作為內(nèi)參基因，分別檢測CC10和Cyclin D1的相對表達量。CC10的上游引物序列為5’-GATCAAGACATGAGGGAGGCA-3’，下游引物序列為5’-CACAGTGAGCTTTGGGCTATTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CAGCGACACCCACTCCTC-3’，下游引物序列為5’-TGAGGTCCACCACCCTGT-3’；Cyclin D1的上游引物序列為5’-CTGGCCATGAA CTACCTGGA-3’，下游引物序列為5’-GTCACACTT GATCACTCTGG-3’。qPCR反應程序為：95 ℃ 5 min；58 ℃ 30 s，39個循環(huán)。擴增結束后，分析溶解曲線，利用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。實驗重復3次。

1.4 外源性CC10的表達檢測

采用Western blotting法。轉染48 h后，參照試劑盒說明書步驟提取細胞的總蛋白，并以BCA法對總蛋白定量。將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠進行蛋白分離后，轉膜。取PVDF膜于封閉液中封閉1 h。分別加入1：500倍稀釋的CC10多抗、GAPDH單抗和Cyclin D1抗體于4 ℃孵育24 h。經(jīng)封閉液洗滌后，加入1：5 000倍稀釋的二抗于37 ℃孵育1 h。暗室內(nèi)加入ECL化學發(fā)光劑顯影后，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.5 細胞活力檢測

采用CCK-8法。分別于轉染24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，再加入100 μL無血清RPMI1640培養(yǎng)液和10 μL CCK-8檢測液，37 ℃避光孵育2 h，酶標儀檢測各孔450 nm處的OD值。

1.6 細胞凋亡情況檢測

采用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒。轉染48 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1%的Triton X-100冰浴5 min、加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光1 h，封片后立即在熒光顯微鏡（×100）下觀察。隨機選5個視野，對凋亡細胞（發(fā)綠色熒光）進行計數(shù)，取平均值，計算細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/視野下細胞總數(shù)×100%。

1.7 細胞遷移、侵襲能力檢測

采用Transwell實驗法。將轉染48 h后兩組細胞制成懸浮液。在Transwell小室的上室中加入300 μL由RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的細胞懸浮液（約1×105個細胞，0.1% FBS），下室中加入700 μL RPMI1640培養(yǎng)液（20% FBS），每組細胞設3個復孔。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h，用甲醇固定后，0.1%結晶紫于室溫下染色20 min，倒置顯微鏡下隨機選取6個視野（×200）對細胞進行計數(shù)后取平均值，是為遷移細胞數(shù)。

細胞侵襲能力檢測需將40 μL稀釋過的Matrigel基質(zhì)膠（基質(zhì)膠：無血清培養(yǎng)液=1：5）加入Transwell小室內(nèi)，37 ℃孵育2 h。其余步驟與遷移實驗相同。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 CC10在肝癌細胞HepG2、Hep3B中的表達

為了探究CC10在肝癌細胞中的作用，首先通過RT-qPCR檢測了其在人正常肝細胞LO2和肝癌細胞HepG2、Hep3B中CC10 mRNA表達水平，結果如圖1所示，與正常肝細胞相較，肝癌細胞HepG2、Hep3B中CC10 mRNA的表達量顯著降低（P＜0.05），且CC10 mRNA在HepG2中表達較低，故選擇HepG2進行后續(xù)實驗。

圖1 CC10 mRNA在人正常肝細胞LO2和肝癌細胞HepG2、Hep3B中的表達情況

2.2 外源性CC10在HepG2細胞中的表達

為了檢測外源CC10在HepG2細胞中的表達水平，轉染48 h后，分別用RT-qPCR和Western blotting分析其mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，轉染后，與pcDNA 3.1組相比，CC10表達水平明顯升高（P＜0.05），Western blotting的實驗結果與RT-qPCR的結果一致（P＜0.05），見圖2。

2.3 外源性CC10對HepG2細胞增殖和凋亡的影響

為了檢測外源性CC10對HepG2細胞增殖、凋亡水平的影響，分別用CCK-8法和TUNEL法檢測轉染后HepG2細胞的活力和凋亡率。結果如圖3所示，與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-CC10組細胞活力隨著轉染時間的增加而降低（P＜0.05）；轉染48 h后，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。這說明外源性CC10抑制HepG2細胞增殖、促進凋亡。

2.4 外源性CC10對HepG2細胞遷移和侵襲的影響

圖2 外源性CC10在HepG2細胞中的表達情況

為了檢測外源性CC10對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響，分別用Transwell實驗檢測轉染后HepG2細胞遷移和侵襲能力的變化。結果表明，與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-CC10組細胞遷移和侵襲細胞數(shù)量均明顯降低（P＜0.05）。說明外源性CC10抑制HepG2細胞增遷移、侵襲，見圖4。

2.5 外源性CC10對HepG2細胞中Cyclin D1表達的影響

為了檢測外源CC10對HepG2細胞中Cyclin D1表達水平的影響，pcDNA 3.1-CC10質(zhì)粒轉染HepG2細胞48 h后，分別用RT-qPCR和Western blotting分析Cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，轉染后，與pcDNA 3.1組相比，Cyclin D1表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05），Western blotting的實驗結果與RT-qPCR的結果一致（P＜0.05），見圖5。

圖3 外源性CC10對HepG2細胞增殖、凋亡的影響

圖4 外源性CC10對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響

圖5 外源CC10對HepG2細胞中Cyclin D1表達水平的影響

3 討論

近年來肝癌發(fā)病率呈上升趨勢，給人民的生命健康和社會經(jīng)濟帶來巨大的挑戰(zhàn)[10]。我國每年約有38萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[11]。肝癌患者預后整體較差，主要的治療方式有手術治療、肝移植、非手術治療（包括肝動脈化療栓塞、射頻消融治療、放射治療、基因治療、中醫(yī)中藥治療等）[12]?；诨虻姆肿影邢蛑委熓悄壳暗难芯繜狳c之一[13]。

Clara細胞CC10蛋白是一種能抑制腫瘤、抵御炎癥反應、維持人體免疫平衡的分泌蛋白，但其作用機制至今不太明確[14-15]。Weeraratna等[16]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細胞中CC10表達量較正常上皮細胞低，CC10蛋白的表達量下降可作為前列腺癌的一個診斷指標，并且具有預后價值；CC10蛋白具有抗腫瘤增長的活性。Zhong等[17]利用脂質(zhì)體將外源CC10轉染非小細胞肺癌細胞A549，發(fā)現(xiàn)外源CC10表達能阻斷G0/G1的細胞周期進程，并抑制A549細胞增殖、誘導細胞凋亡，抑制效應可能與Cyclin D1基因的下調(diào)有關。Wei等[18]于大腸桿菌中誘導表達并純化重組大鼠CC10蛋白，然后用重組蛋白處理大鼠ASMCs細胞，結果證明重組CC10蛋白可抑制PDGF誘導的大鼠氣管平滑肌細胞增殖和遷移，推測抑制作用可能與抑制細胞周期蛋白D1表達有關。鐘聲等[19]證明CC10表達下調(diào)與NSCLC細胞的凋亡密切相關。最新的一項研究表明，CC10蛋白可通過抑制Fgl2蛋白的表達緩解小鼠肝炎病毒株3誘導的暴發(fā)性肝炎[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞HepG2、Hep3B中CC10的表達量較人正常肝細胞LO2顯著降低。且外源CC10能抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進肝癌細胞凋亡，與前人結果類似。

Cyclin D1屬于原癌基因，通過與CDK6或CDK4結合形成復合物在調(diào)節(jié)細胞周期過程中發(fā)揮作用。多種腫瘤細胞中均可檢測到該基因的擴增、突變和高表達，且其表達量與患者預后呈顯著負相關[21-23]。敖然等[24]發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白在人正常癌旁組織中不表達，而在肝癌細胞的細胞質(zhì)和/或細胞核及肝癌組織中高表達量。Zhao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織。此外，Cyclin D1蛋白在宮頸癌組織中的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織[26]。因此，下調(diào)Cyclin D1基因的表達可能是抑制肝癌細胞生長的一種可能的機制。本研究中，外源CC10基因表達使得肝癌細胞HepG2中Cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平明顯下調(diào)。因此，我們推測CC10可通過下調(diào)Cyclin D1的表達抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，外源CC10基因表達對HepG2細胞具有抑制增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡的作用，其機制可能與下調(diào)Cyclin D1蛋白表達有關。