朱穎 湯玉茗 黃佳 李為光 章永平 王建承 張學軍 姚瑋艷

上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200025

本課題組既往研究結(jié)果顯示全反式維甲酸能誘導多株胰腺癌細胞凋亡[1]，通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸誘導胰腺癌細胞凋亡過程中腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF related apoptosis induced ligand, TRAIL)的受體(TRAIL-R)顯著升高，經(jīng)體內(nèi)外實驗證實TRAIL的表達隨全反式維甲酸誘導時間的延長而增高。本研究旨在通過瞬時轉(zhuǎn)染TRAIL基因進一步探索TRAIL對胰腺癌細胞的促凋亡機制。

材料與方法

一、細胞株及質(zhì)粒的制備、鑒定及轉(zhuǎn)染

3株人胰腺癌細胞株SW1990、PaTu8988和BxPC3，攜帶TRAIL基因的真核表達載體pCA13(pCA13-TRAIL)、空質(zhì)粒(pCA13)和帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的pCA13-EGFP質(zhì)粒由中科院上海生命科學研究院生化細胞所提供。制備感受態(tài)大腸桿菌，分別加入pCA13-TRAIL、pCA13或pCA13-EGFP混勻，處理后涂布于LB平板上常規(guī)培養(yǎng)10 h，挑取單個克隆接種于培養(yǎng)基中，獲取細菌，常規(guī)抽提質(zhì)粒。

通過BglⅡ酶切和SalⅠ、HidⅢ雙酶切及PCR鑒定TRAIL質(zhì)粒是否制備成功。采用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株(pCA13-TRAIL組)，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對照組(pCA13組)。以轉(zhuǎn)染pCA13-EGFP的細胞在高倍視野下計算質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率，即質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率=帶綠色熒光細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

二、TRAIL mRNA和蛋白表達檢測

分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h收取細胞，抽提總RNA及制備蛋白勻漿。采用RT-PCR方法檢測TRAIL(860bp)mRNA表達。引物正義序列為5′-ATGGCTATGATGGAGGTCCAG-3′，反義序列為5′-ACTGGCTTCATGGTCCATGTC-3′；內(nèi)參β-actin引物正義序列為5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′；反義序列為5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′。引物由上海博亞生物技術有限公司設計合成。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA 相對表達量。

蛋白定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測TRAIL蛋白表達，以β-actin為內(nèi)參。鼠抗人TRAIL單抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，1∶100稀釋；鼠抗人β-actin抗體購自美國Sigma公司，1∶4 000稀釋。羊抗鼠二抗1∶4 000稀釋。最后ECL發(fā)光，X片曝光顯影后用凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描條帶灰度值，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白表達量。

三、細胞凋亡的形態(tài)觀察及凋亡率檢測

細胞用2.5%戊二醛4℃固定1 h以上。常規(guī)包埋、超薄切片，通過透射電鏡觀察細胞形態(tài)。收集各組對數(shù)生長期細胞，離心后棄上清液，重懸細胞，密度調(diào)整為2×105個/ml。采用TUNEL法檢測細胞凋亡率。TUNEL試劑盒購自美國Roche公司，嚴格按說明書操作。用熒光顯微鏡(日本Nikon公司)在波長510～520 nm下觀測TUNEL染色，在波長400～420 nm下觀察Hoechst染色。

四、TRAIL-R1、R2蛋白表達檢測

取含106胰腺癌細胞的懸液滴在涂有polylysine的玻片上，加10 μl PE熒光標記的鼠抗人TRAIL-R1或TRAIL-R2抗體(美國Diaclone Biosciences公司)，熒光顯微鏡拍照記錄后置流式細胞儀檢測TRAIL-R1、R2的表達，根據(jù)細胞熒光強度分析計算細胞TRAIL-R1或TRAIL-R2表達率。

五、caspase-3蛋白表達檢測

采用免疫組織化學方法檢測caspase-3的表達。收集細胞加穿透液(0.1%TritonX-100，0.1%檸檬酸鈉溶液)冰上作用2min，離心后加兔源性caspase-3抗體(1∶100，美國Cell Signaling Technology公司)，洗滌后加Cy-3 熒光標記抗兔二抗(1∶1 000，美國Jakson公司)，用熒光顯微鏡拍照記錄，計算陽性細胞占總細胞的百分率。

六、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、胰腺癌細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率

經(jīng)酶切鑒定，pCA13-TRAIL重組質(zhì)粒成功擴增出1條860 bp的TRAIL基因條帶，表明攜帶TRAIL的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。SW1990、PaTu8988和BxPC3細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率分別為(69.88±9.92)%、(26.52±10.01)%和(38.60±11.02)%，其中PaTu8988的轉(zhuǎn)染率較低。

二、胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TRAIL mRNA及蛋白表達的變化

SW1990、PaTu8988和BxPC3的pCA13-TRAIL組24 h后TRAIL mRNA的表達量分別為0.5967±0.0605、0.3250±0.0323和0.5033±0.0879，48 h后分別為0.6460±0.0973、0.3367±0.0649和0.5310±0.0776；24 h后TRAIL蛋白的表達量分別為0.5490±0.0717、0.2813±0.0595和0.4107±0.1084，48 h后分別為0.6227±0.0439、0.3633±0.0541和0.4267±0.0829。pCA13-TRAIL組mRNA和蛋白的表達均顯著高于pCA13組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。

三、胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細胞凋亡率的變化

SW1990、BxPC3、PaTu8988細胞轉(zhuǎn)染TRAIL后的細胞凋亡率均較pCA13組增加，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

四、胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TRAIL-R1、R2的表達變化及其與細胞凋亡率的相關性

轉(zhuǎn)染TRAIL后SW1990、BxPC3、PaTu8988細胞TRAIL-R1表達均上調(diào)，除轉(zhuǎn)染72 h的BxPC3細胞外，其他各時間點的表達均顯著高于pCA13組，差異有統(tǒng)計學意義(表2)；轉(zhuǎn)染TRAIL后SW1990、BxPC3細胞TRAIL-R2表達均上調(diào)，除轉(zhuǎn)染24 h的SW1990細胞外，其他各時間點的表達均顯著高于pCA13組，差異有統(tǒng)計學意義，而轉(zhuǎn)染TRAIL后PaTu8988細胞的TRAIL-R2表達與pCA13組差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表1 3株人胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細胞凋亡率

表2 3株人胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的TRAIL-R1、TRAIL-R2陽性表達率

轉(zhuǎn)染TRAIL后SW1990細胞的TRAIL-R1、R2表達與凋亡率均呈正相關(r值分別為0.764、0.683，P值均<0.05)；PaTu8988細胞的TRAIL-R1的表達與凋亡率呈正相關(r=0.743，P<0.05)，TRAIL-R2表達與凋亡率呈弱相關(r=0.507，P=0.093)；BxPC3細胞的TRAIL-R2表達明顯升高，與凋亡率呈正相關(r=0.743，P<0.01)，TRAIL- R1表達與凋亡率呈弱相關(r=0.573，P=0.052)。

五、胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后caspase-3蛋白表達的變化

轉(zhuǎn)染pCA13-TRAIL質(zhì)粒后，SW1990、PaTu8988和BxPC3細胞caspase-3陽性表達率分別為(14.64±5.35)%、(9.92±5.50)%和(16.12±6.74)%，均較pCA13組的(3.01±1.50)%、(1.75±0.50)%和(3.79±1.58)% 顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

六、胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細胞超微結(jié)構(gòu)改變

透射電鏡下可見細胞出現(xiàn)凋亡的各種特征(圖1)，細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，胞膜起泡，凋亡小體形成，被鄰近細胞吞噬。

圖1 轉(zhuǎn)染pCA13-TRAIL后人胰腺癌細胞株SW1990(1A)、PaTu8988(1B)、BxPC3(1C)電鏡下改變(×7400倍，↑為凋亡細胞)

討 論

胰腺癌治療手段中，基因和細胞療法是可行的，并且可以與標準治療和(或)免疫治療協(xié)同抗腫瘤[2]?；蛑委煹挠行О悬c包括抑癌基因p53、K-ras基因突變，抗血管生成基因受體VEGFR、自殺基因HSK-TK，胞嘧啶脫氨酶和細胞色素P450等[3]。TRAIL通過與其受體TRAIL-R1和TRAIL-R2結(jié)合，誘導死亡誘導信號復合物的形成，激活凋亡級聯(lián)反應[4]。

瞬時轉(zhuǎn)染攜帶基因的病毒質(zhì)粒使動物細胞表達目的基因被廣泛運用[5]，一種新的嵌合型腺病毒Ad.5/3-mda-7通過提供mda-7/IL-2顯示出更好的療效[6]。本研究利用攜帶TRAIL基因的真核載體pCA13轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞，轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)TRAIL表達上調(diào)，48 h達高峰，且與細胞凋亡率升高呈正相關，提示TRAIL能誘導其受體R1、R2的表達，進而促進細胞凋亡。BxPC3細胞轉(zhuǎn)染后TRAIL-R1、R2的表達量較SW1990、PaTu8988細胞株低，但轉(zhuǎn)染后凋亡率并不低，可能與其轉(zhuǎn)染后TRAIL-R2表達量顯著增加有關，提示TRAIL-R1、R2均參與了TRAIL誘導的胰腺癌細胞凋亡。

caspase-3的活性可作為細胞凋亡的指標[7]。有學者認為某些細胞株對外源性TRAIL耐藥，但二甲雙胍明顯增強TRAIL誘導的直腸癌細胞凋亡，并顯示caspase被激活[8]。本研究結(jié)果也證實caspase-3的活化在TRAIL所誘導的細胞凋亡中起一定的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突