何思穎，杜鵬輝，張 磊，楊 娜，鄭 芳△

(1.武漢大學中南醫(yī)院基因診斷中心,湖北武漢 430071；2.武漢大學中南醫(yī)院檢驗科,湖北武漢 430071；3.中國地質大學(武漢)醫(yī)院，湖北武漢 430071)

血脂水平過高可引起一系列嚴重疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病、慢性腎功能衰竭等[1-2]。目前常見降脂藥主要有他汀類、葉酸類以及抗氧化劑類等[3-5]，其中他汀類藥物應用廣泛。他汀類為3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的選擇性抑制劑，能減少內(nèi)源性膽固醇的合成，同時反饋刺激肝細胞膜外低密度脂蛋白受體數(shù)量增加、活性升高，從而達到降脂目的[6]。

研究表明，ApoE常見基因多態(tài)性與他汀類藥物降脂療效相關，e2等位基因攜帶者使用他汀類藥物的降脂效果比其他等位基因攜帶者更為明顯[7]。2017年中國人群的研究表明，ApoE基因型e3/e3的患者經(jīng)阿托伐他汀治療后血脂水平的下降程度高于e3/e4型患者[8]。總結現(xiàn)有研究，攜帶Apoe2的個體降脂效果好于攜帶Apoe3的個體，攜帶Apoe4的個體則相反?；趀2和e4等位基因攜帶不同，將ApoE基因分3個表型組，即E2(e2/e2,e2/e3)、E3(e3/e3,e2/e4)和E4(e3/e4,e4/e4)，國外研究建議按不同表型進行藥物敏感型分析[9]，但這種按等位基因攜帶進行分組的模式在臨床應用中適用嗎？同時攜帶e2和e4基因的個體調脂療效如何？此外，他汀類藥物因人種和用藥劑量不同[10]，按照ApoE基因表型進行個體化用藥在國際上仍存在爭議，國外有關他汀類藥物分層分析[11]的結果在中國人群中是否適用，仍有待數(shù)據(jù)驗證，特別是吸煙、飲酒等日常生活習慣是否會影響ApoE基因型個體藥物的療效，國內(nèi)外鮮有報道。

基于上述分析，本文應用Sanger測序技術對ApoE基因進行分型，通過觀察血脂變化率，研究ApoE基因多態(tài)性對兩種他汀類藥物療效的影響，比較吸煙、飲酒對他汀類藥物療效的影響，給臨床醫(yī)師提供精準的個體化治療方案。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年9月1日至2017年4月30日在武漢大學中南醫(yī)院使用他汀類藥物降脂治療超過4周的血脂異?；颊?23例，其中男166例，女57例，平均年齡65歲。血脂異常的納入標準為：(1)血清總膽固醇(TC)>5.18 mmol/L，(2)三酰甘油(TG)>1.7 mmol/L，(3)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)<1.04 mmol/L，(4)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)>3.63 mmol/L，(5)脂蛋白a[Lp(a)]>300 mg/L，只要滿足上述條件中任意一條，即作為血脂異?；颊?。查詢血脂異?；颊吲R床資料，將有他汀類藥物用藥記錄的患者納入研究，并排除在第1次查脂前已有降脂類藥物用藥史的患者和聯(lián)合使用多種降脂藥的患者。223例患者平均TC水平為(5.60±0.97)mmol/L，TG水平為(2.83±1.51)mmol/L，HDL-C水平為(1.17±0.32)mmol/L，LDL-C水平為(3.11±0.99)mmol/L，Lp(a)水平為(206.66±217.93)mg/L。

患者應用目前國內(nèi)臨床上使用最為廣泛的兩種他汀類藥物進行治療，阿托伐他汀用藥量20 mg/d(立普妥20 mg*7，輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051408)，瑞舒伐他汀用藥量10 mg/d(瑞舒伐他汀鈣片5 mg*14，IPR Pharmaceuticals，INCORPORATED，國藥準字J20170008)，持續(xù)用藥至少4周。查詢患者吸煙飲酒史，根據(jù)患者主訴，將吸煙或飲酒長達1年及以上且延續(xù)至今，或戒斷不足6個月的患者(排除偶爾且極少量吸煙、飲酒者，即每周1～2根的吸煙者及低度數(shù)少量，每周1～2次的飲酒者)，編入“吸煙飲酒組”，沒有吸煙或飲酒史，或偶爾極少量攝入，或戒斷超過半年的患者編入“無吸煙飲酒組”。實驗中所有對象均已知情同意。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 ApoE目的片段的擴增使用杭州柏恒科技有限公司的GT9612型基因擴增儀，基因分型采用Sanger測序檢測，所用儀器為ABI公司的3730XL DNA測序儀。血脂指標采用奧林巴斯AU5400進行檢測。

1.2.2試劑 血液基因組DNA提取試劑盒盒PCR相關試劑為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，PCR所用引物均由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成?？偰懝檀荚噭┖?酶法)、三酰甘油試劑盒(GPO-POD法)為貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。高、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒(直接法)、脂蛋白a試劑盒(膠乳凝集比濁法)為北京積水醫(yī)療科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1ApoE基因分型 空腹12 h后于次日早晨抽取全血(EDTA-K2抗凝)2 mL，提取全血細胞DNA，對ApoE樣基因片段進行PCR擴增，擴增片段長度292 bp，上游引物5′-AAC AAC TGA CCC CGG TGG CG-3′，下游引物5′-ATG GCG CTG AGG CCG CTC GG-3′，PCR擴增反應參數(shù)如下：95 ℃ 12 min，94 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，1個循環(huán)；95 ℃ 1 min，64.8 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，1個循環(huán)。擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行Sanger法測序，223例患者樣本均通過測序判斷ApoE基因分型情況，依據(jù)rs429358(ApoE蛋白112位氨基酸，測序圖上70位左右堿基)和rs7412(ApoE蛋白158位氨基酸，測序圖上210位左右堿基)的堿基種類不同分6種基因型(圖1)：(1)二者均為T純合：e2/e2；(2)rs429358處T純合，rs7412處T和C雜合：e2/e3；(3)rs429358處T純合，rs7412處C純合：e3/e3；(4)rs429358處T和C雜合，rs7412處C純合：e3/e4；(5)二者均為C純合：e4/e4；(6)二者均為T和C雜合：e2/e4。

注：A為rs429358位堿基對T純合；B為rs429358位堿基對T/C雜合；C為rs429358位堿基對C純合；D為rs7412位堿基對C純合；E為rs7412位堿基對T/C雜合；F為rs7412位堿基對T純合

圖1rs429358和rs7412位點測序結果展示

1.3.2血脂指標檢測 治療前和治療時長≥4周后，空腹12 h于次日早晨采取靜脈血，離心取血清，于中南醫(yī)院檢驗科檢測TC，TG，HDL-C，LDL-C和Lp(a)。

1.3.3血脂變化率 血脂變化率=(用藥前血脂指標-用藥后血脂指標)/用藥前血脂指標。

2 結 果

2.1血脂異?；颊叩腁poE分型 223例患者中e2/e2占0.4%(1例)，e2/e3占14.8%(33例)，e3/e3占61.4%(137例)，e3/e4占20.6%(46例)，e4/e4占0.9%(2例)，e2/e4占1.8%(4例)。將受試者分為3個表型組E2型(e2/e2和e2/e3型)，E3型(e3/e3和e2/e4型)和E4型(e3/e4和e4/e4型),其所占的百分比分別為15.2%(34例)，63.2%(141例)和21.5%(48例)。

2.2ApoE分型對血脂水平的影響

2.2.1性別和年齡對血脂水平的影響 應用成組t檢驗比較不同性別和年齡組(以平均年齡為界，<65歲和≥65歲兩組)間各血脂變化率指標，其結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此可以將不同性別和不同年齡亞組合并研究。

2.2.2E2表型影響他汀類藥物的降脂效果 TC、TG、HDL-C和LDL-C的血脂變化率由大到小依次為E2、E3、E4，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E2和E3表型組，E3和E4表型組，E2和E4表型組間兩兩比較，治療后的TC和LDL-C水平存在E2E3>E4，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E2型HDL-C的增高變化率較E3、E4型增高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但E3和E4型之間差異則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。他汀類藥物調節(jié)Lp(a)水平呈E2>E3>E4趨勢，但各分型間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3兩種他汀類藥物的分析 兩種他汀類藥物調節(jié)血脂水平稍有不同，如阿托伐他汀調節(jié)TC的能力優(yōu)于瑞舒伐他汀。E2型和E3型TG水平高者對阿托伐他汀更敏感，E4型TG水平高者對瑞舒伐他汀更敏感。E2和E4型HDL-C水平低者對阿托伐他汀更敏感，E3型HDL-C水平低者對瑞舒伐他汀更敏感，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 不同他汀類藥物對各ApoE分型患者

表1 ApoE不同ApoE2，E3，E4表型患者他汀類藥物治療前后血脂變化情況比較(n=223)

續(xù)表1 ApoE不同ApoE2，E3，E4表型患者他汀類藥物治療前后血脂變化情況比較(n=223)

2.4吸煙飲酒影響他汀類藥物降血脂效果 他汀類藥物降低E2表型中吸煙飲酒者TC變化率的效果明顯弱于無吸煙飲酒者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他二型中吸煙飲酒不利于他汀類藥物調節(jié)機體TC、TG、HDL-C和LDL-C，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：*表示P<0.05

圖3吸煙飲酒狀況對不同ApoE分型患者降脂療效的影響

3 討 論

他汀類藥物在參與血脂調節(jié)的過程中，有大量基因編碼的蛋白參與調脂，其中ApoE既能和存在于肝臟的低密度脂蛋白受體(LDL-R)和極低密度脂蛋白受體(VLDL-R)結合，又能和遍及全身組織的脂蛋白結合，可通過多種代謝途徑參與機體的脂質代謝，成為影響機體血脂水平的重要內(nèi)在因素[12]。

ApoE基因DNA鏈上存在堿基突變，相應的112位和158位氨基酸改變，野生型e3的112位上為精氨酸,158位上為賴氨酸，兩種氨基酸的交換決定了異構體的種類[13]。不同等位基因型的ApoE蛋白對極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的代謝能力不同，其中ApoE4型由于與脂蛋白的結合能力強，代謝快，細胞反饋性減少LDL的攝入，血中LDL-C水平升高[14]，所以可以將6種ApoE基因型的個體基于等位基因的不同而歸為3種表型。不同的ApoE表型不僅影響未干預狀態(tài)下的血脂水平，還影響降脂藥物的治療效果，因此有學者認為應該根據(jù)ApoE的基因型選取不同的降脂療法，而ApoE多態(tài)性與藥物敏感性的相關分析也成為研究的熱點[15]。

本研究引用血脂變化率這一指標，對治療前血脂水平不同的患者群體進行比較。研究發(fā)現(xiàn)，在降低TC、TG和LDL-C水平方面中，E2型對他汀類藥物的治療最為敏感，血脂下降最為顯著，E3型次之，E4型的療效較差，而在降低HDL-C水平方面，E2型仍是對他汀藥物敏感性最高的一型，而E3和E4型之間的差異并不明顯。TC、TG、LDL-C和HDL-C 4種血脂指標平行比較顯示，LDL-C對他汀類藥物的敏感性最高，而HDL-C的變化率明顯小于TC、TG和LDL-C，說明他汀類藥物調節(jié)HDL-C的能力較低。在降低Lp(a)方面，表型與藥物敏感型之間存在相關趨勢，但這種相關性是否存在統(tǒng)計學差異，以及ApoE分型對他汀類藥物調節(jié)HDL-C的影響仍需擴大數(shù)據(jù)收集，做進一步分析。

研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物種類對不同血脂指標變化率的影響也存在一定差異，3個表型組均顯示阿托伐他汀對TC的調節(jié)能力優(yōu)于瑞舒伐他汀。E2型和E3型TG高者對阿托伐他汀更敏感，E4型TG高者對瑞舒伐他汀更敏感。針對E2型和E4型HDL-C低者，阿托伐他汀療效優(yōu)于瑞舒伐他汀，而E3型HDL-C低者則相反，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各表型受藥物不同影響而產(chǎn)生的療效差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但這種藥物不同引起的降脂療效差異與基因分型是否相關，也需要擴大實驗數(shù)據(jù)進一步統(tǒng)計分析。

研究還發(fā)現(xiàn)，以吸煙、飲酒為代表的生活習慣同樣可對他汀類藥物的療效產(chǎn)生影響。從總體上看，不吸煙、飲酒的生活方式有利于他汀類藥物發(fā)揮療效，尤其見于對TC、TG和HDL-C的調節(jié)，其中又以TC降低率受吸煙飲酒情況影響最為明顯。觀察4個血脂指標下3個表型組發(fā)現(xiàn)，E2型受吸煙飲酒生活習慣的影響最為顯著，而對E4組治療效果的影響不明顯。調節(jié)生活習慣有助于藥物療效發(fā)揮，這將有利于臨床的針對性用藥，然而對于這種關系的確認和探索同樣需要進一步擴大數(shù)據(jù)收集。

總結上述研究結果對臨床血脂異?；颊咛岢鏊☆愃幬镉盟幗ㄗh：(1)在穩(wěn)定安全劑量的前提下，可以適當加大E3型和E4型患者的每日用藥劑量，或者聯(lián)合其他降脂藥物使用；(2)針對HDL-C為唯一異常指標的血脂異常患者，可以換用其他非他汀類降脂藥；(3)TC水平高者三型均推薦使用阿托伐他汀，TG含量高者中E2、E3表型患者推薦使用阿托伐他汀，E4表型患者推薦使用瑞舒伐他汀；(4)在E2型血脂異?；颊叩闹委熤袕娬{對生活習慣的糾正治療，在維持血脂水平的前提下，改善生活習慣，適當減少用藥量，以減少對肝、腎、肌肉等組織器官的損害[16]；(5)E4表型個體，其LDL-C治療后均值既無法達到2016年血脂異常防治指南中針對動脈硬化性心血管疾病(ASCVD)一級預防的理想LDL-C值(2.60 mmol/L)，也無法達到對危者調脂治療設定的目標值(2.60 mmol/L)，血脂變化率也低于目標變化量30%[17]。因此建議臨床上對E4表型且具有危險因素(高血壓，糖尿病、吸煙或BMI≥28 kg/m2等)的個體進行關注，對這部分患者建議加大藥物劑量。

4 結 論

本研究證實了中國人群中他汀類藥物可改善ApoE表型E2、E3、E4型患者的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，其降脂療效逐漸降低，即改善程度有E2>E3>E4。此外還發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀與瑞舒伐他汀的降脂療效與ApoE基因分型無明顯關系，吸煙飲酒影響他汀類藥物降脂療效，并顯著見于E2型血脂異?；颊?。