柳曉琴，崔亞利，沈 川，甘春玉，段義飛，彭磊文，李文勝△

(1.四川大學華西第二醫(yī)院臨床檢驗科,四川成都 610041；2.出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室,四川成都 610041)

病毒、細菌和非典型病原體是兒童患者3大類主要致病源，病毒感染是引起兒童呼吸道感染的重要原因[1]。呼吸道病毒的檢測可以通過抗原或抗體進行檢測鑒定，有資料證實，應用直接熒光免疫方法(DFA)對抗原進行早期檢測，可以使患者接受治療的時間降低2.5～4 d[2-3]。不同年齡階段的患兒對病毒的耐受力不同，免疫器官和組織發(fā)育階段不一致，患兒感染后會有不同程度的癥狀，尤其是處于嬰兒階段，一旦發(fā)病可能危及生命，所以早期明確病毒感染亟待解決[4-5]。

為了解本地區(qū)呼吸道病原體感染的病原學構成和流行病學特征，本研究回顧性收集2016年4月至2018年3月期間在四川大學華西第二醫(yī)院就診的7 360例急性呼吸道感染患兒呼吸道病毒抗原的檢測結果，以期為臨床醫(yī)生對這類患者進行早期診斷，治療及合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年4月至2018年3月在四川大學華西第二醫(yī)院就診，經(jīng)臨床確診為急性呼吸道感染、急性喘息性支氣管炎、急性扁桃體炎、急性支氣管炎、急性肺炎和急性重癥肺炎的疾病，年齡為0～15歲的患兒。

1.2標本采集 根據(jù)本科的《標本采集標準程序》要求在患兒平躺或頭仰起時，用植絨拭子從鼻孔插入鼻腔，到達鼻咽部來回旋轉2～3次后迅速抽出拭子放入加有2 mL生理鹽水的七聯(lián)檢專用離心管中，并立即送檢。

1.3試劑與儀器 7項呼吸道病毒檢測試劑盒(免疫熒光法)為美國Diagnostic Hybrids,Inc.公司的產(chǎn)品。檢測項目包括流感病毒A型(Flu A)、流感病毒B型(Flu B)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)。2016年4月至2018年3月期間，所使用的批號分別為7R111715B、7R030916D、085046、092922、105269和114347，新批號啟用前，均按照ISO15189要求做新舊批號標本比對，陰陽性結果均一致。采用奧林巴斯BX43 LED熒光顯微鏡觀察結果。

1.4操作方法

1.4.1樣本處理 將植絨拭子樣本在旋渦混勻器上劇烈渦旋混勻約30 d，見渾濁后去掉植絨拭子，離心2 000 r/min，10 min，棄去上清液(留400～500 μL )，吸管吹打混勻，形成混濁的細胞懸浮液。

1.4.2樣本制片 每份樣本在8孔的載玻片上，每孔中分別加入25 μL樣本懸浮液。在電吹風冷風下風干10～15 min至干燥后浸沒在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

1.4.3樣本反應 每份樣本的1孔到7孔分別加D3試劑(Flu A、Flu B、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、ADV)25 μL，必須完全覆蓋待測樣本，將載玻片放在濕盒中置于37 ℃水浴箱，孵育15～30 min，取出載玻片用PBS沖洗1遍，后浸沒在PBS中洗2遍。

1.4.4樣本觀察 在載玻片中央加1滴封閉液，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.5結果判斷 熒光顯微鏡下顯示蘋果綠熒光的細胞為陽性細胞，而被Evans藍染成紅色的細胞為陰性細胞。當放大倍數(shù)為200倍時，在視野中找到≥2個陽性細胞，判為標本陽性。陰性對照/陽性對照處理同樣本處理流程。合格的樣本要求在放大倍數(shù)為200倍下，每個視野至少有2個上皮細胞。陰性結果為至少含有20個柱狀上皮細胞的樣本中無熒光染色。如果樣本中上皮細胞數(shù)量少于20個則為樣本不合格，應重新采樣再進行檢測。

1.5統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析處理，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1呼吸道病毒總檢出率 7 360例急性呼吸道感染標本中，783例標本呼吸道病毒抗原檢測結果呈陽性，陽性率為10.64%(783/7 360)，其中2項同時有陽性結果的8例，以RSV合并感染最常見，占總陽性標本的0.11%；陽性率最高的是RSV(7.40%)，其次為PIV3(1.45%)，ADV(0.84%)，F(xiàn)lu B(0.34%)，F(xiàn)lu A(0.33%)，PIV1 (0.24%)和PIV2(0.03%)。結果見表1。在7 360例患兒檢測結果中，按年齡分為3組：嬰兒組(≤1歲)，幼兒組(1～3歲)，學齡后組(≥3歲)。不同年齡組患兒呼吸道病毒陽性率見表2。多組樣本間呼吸道七聯(lián)檢用χ2檢驗，由表2結果可知，嬰兒組與幼兒組病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=120.89，P<0.001)；幼兒組與學齡后組病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=34.72，P<0.001)；嬰兒組與學齡后組病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=280.44，P<0.001)。

表1 7項呼吸道病毒檢測結果

2.2不同季節(jié)患兒呼吸道病毒發(fā)病率 此次統(tǒng)計得出，男性患兒4 288例，發(fā)病患兒陽性率占11.22%，其中，女性患兒3 072例，發(fā)病患兒陽性率占9.83%。男性與女性患兒檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=7.705，P>0.05)。按四季發(fā)病率統(tǒng)計，春季發(fā)病患兒2 328例，患兒陽性率占14.05%；夏季發(fā)病患兒1 695例，患兒陽性率占4.72%；秋季發(fā)病患兒1 449例，患兒陽性率占5.31%；冬季發(fā)病患兒1 888例，患兒陽性率占16.37%。春季與夏季檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=105.933，P<0.001)；秋季與冬季檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=114.824，P<0.001)；秋季與冬季檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=105.933，P<0.001)；春季與冬季檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=29.851，P<0.001)。

表2 不同年齡組患兒呼吸道病毒檢測結果

表3 不同季節(jié)患兒呼吸道病毒發(fā)病率

3 討 論

引起呼吸道感染的病原體種類繁多，導致呼吸道感染病情復雜，臨床癥狀多樣[6]。因此，對于引起呼吸道感染的呼吸道病原體的準確診斷變得十分重要，應及早干預、診斷與治療，以降低其發(fā)病率及病死率[7-8]。這不僅對感染患者的健康恢復有重要的價值，另一方面，盡早發(fā)現(xiàn)疑似病例，快速確認病原體，有利于對病原體流行爆發(fā)的控制，以避免危及更廣泛的人群，也可為流行病學調查、疾病治療及疫情防治提供強有力的支持[6,9]。

急性呼吸道感染中80%由呼吸道病毒引起，研究表明呼吸道病毒七聯(lián)檢是檢測小兒呼吸道病毒感染的有效手段[10-11]。近年來，有研究表明嬰幼兒急性肺炎是我國住院患兒死亡的主要原因之一[12]，每年因呼吸道感染病死的兒童占患兒死亡人數(shù)的20%左右，嚴重影響著兒童的身體健康[13-14]。兒童呼吸道的感染與病原體、年齡、飲食、心理及兒童所在的地區(qū)差異有關，其中病原體因素占主導地位。隨著科技的發(fā)展，抗菌藥物的生產(chǎn)隨之增多，臨床上的抗菌藥物得到廣泛應用，呼吸道感染有所降低，但其他病原體感染卻有上升之勢[15-16]。錢熊杰等[17]的研究表明，兒童急性呼吸道感染中，上呼吸道感染主要由病毒引起(53.78%)。

本研究結果顯示，7 360例急性呼吸道感染患兒標本中，有783例呼吸道病毒檢測結果呈陽性，陽性率達10.64%。陽性率由高到低依次為RSV、PIV3、ADV、Flu B、Flu A、PIV1、PIV2，這與FEARNS等[18]報道的結果是一致。在年齡分組結果中，嬰兒組患兒檢出陽性率遠高于幼兒組和學齡后組，這提示臨床醫(yī)生嬰兒呼吸道病毒感染的概率高于幼兒和學齡后兒童，進一步提示這類患兒就診時可以進行早期呼吸道病原體篩查。春季和冬季7項呼吸道病毒感染的檢出率遠高于夏季和秋季，這與賴偉蘭等[19]得出的結論一致。本研究結果發(fā)現(xiàn)，急性呼吸道感染情況受年齡和季節(jié)的影響較大，并表現(xiàn)出各年齡段兒童的感染率不同。鑒于近年來RSV感染明顯增多，每個地區(qū)一年四季均可發(fā)病，常引起嚴重的呼吸道疾病，所以在臨床上不容忽視[20]。流感病毒感染發(fā)生高峰在北半球一般是從11月至來年4月，腺病毒出現(xiàn)在深冬到夏初，RSV通常是在冬天到早春，持續(xù)5個月流行，副流感病毒爆發(fā)會持續(xù)1年。

通過檢測呼吸道病毒抗原可有效發(fā)現(xiàn)疫情的暴發(fā)流行，早期進行呼吸道病毒七聯(lián)檢可以及時有效地篩查出患兒所感染病毒種類，監(jiān)測患兒病情，指導臨床合理的用藥，為做好嬰幼兒的預防及醫(yī)院儲備相關藥品等起到一定提示作用，進而為嬰幼兒急性呼吸道感染治療的相關探索研究提供流行病學依據(jù)。但是，該檢測方法存在一定局限性，如標本采集質量不合格易發(fā)生漏檢，且檢測結果未經(jīng)核酸檢測驗證，可能出現(xiàn)假陽性。盡管如此，該方法相較于核酸檢測對人員及設備要求均不高，且成本較低，可廣泛適用于基層醫(yī)院開展。早期診斷對使用抗病毒藥物治療、緩解流感癥狀、縮短病程、降低并發(fā)癥發(fā)生率、縮短排毒時間、降低病死率有積極作用，在流行期間，預防性使用抗病毒藥物可能降低患病率，節(jié)省患者開支和醫(yī)院資源。

4 結 論

呼吸道病原體的準確檢測對呼吸道感染的早期診斷、干預及治療具有重要的指導意義。急性呼吸道感染情況受年齡和季節(jié)影響大。呼吸道病毒七聯(lián)檢是檢測小兒呼吸道病毒感染的有效手段。