楊 奇，史清海，牛莉莉，王 黎，李 凱，鄧夢(mèng)蕓，胡慧婷，伏建峰△

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832002；2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)診斷中心，新疆烏魯木齊 830000；3.新疆昌吉州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆昌吉 831100)

腦出血(ICH)占急性腦卒中的15%～20%，具有高發(fā)病率和高病死率[1]。ICH后，血腦屏障(BBB)損傷，腦水腫和炎癥等病理生理過程被激活，參與相關(guān)過程的分子可能是診斷及病情評(píng)估潛在生物標(biāo)志物[2]。腦脊液(CSF)是具有許多重要功能一種體液，并與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的細(xì)胞外環(huán)境直接接觸，是CNS各種物質(zhì)代謝的媒介[3]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和酸性鈣結(jié)合蛋白(S100β)屬于CNS的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，被廣泛用作CNS組織損傷的特異性生物標(biāo)志物[4]。到目前為止，大多數(shù)研究主要集中在血液中，考慮到腦或脊髓與CSF之間的緊密解剖和功能關(guān)系，在CNS損傷時(shí)CSF中特異性結(jié)構(gòu)蛋白濃度可能迅速且明顯增加[5]。微小RNA(miRNA)是短的非編碼RNA(20～24個(gè)核苷酸)，其在腦組織中含量豐富，人體體液的基因表達(dá)譜和ICH實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)提示miRNA是重要的基因調(diào)節(jié)因子且與神經(jīng)系統(tǒng)疾病息息相關(guān)[6]，而目前ICH患者CSF中miRNA表達(dá)變化的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究通過分析ICH患者CSF NSE、S100β表達(dá)水平及發(fā)生顯著改變的miRNA，探討其對(duì)腦出血疾病的診斷價(jià)值及對(duì)病情的評(píng)估。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年4月期間在新疆軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科確診的新發(fā)ICH 26例患者作為病例組，其中基底節(jié)出血15例，丘腦出血4例，腦干出血4例，腦葉出血3例；男15例，女11例，年齡(56.70±14.50)歲，出血量35.00(23.25,65.45)mL。對(duì)照組22例；男14例，女8例，年齡(34.86±12.46)歲。診斷符合中國腦出血診治指南(2014)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并符合納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為原發(fā)性出血病例；(2)經(jīng)臨床醫(yī)生系統(tǒng)評(píng)估(病史、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、影像學(xué)檢查(CT/MRI)符合自發(fā)性腦出血指針；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先天性血管病、血管炎；自身免疫系統(tǒng)疾病；(2)顱腦手術(shù)史、外傷史、腫瘤史(肺癌、黑色素瘤)、血液病史、心腦卒中史；(3)近期口服抗凝、抗血小板藥物；(4)無法配合抽取CSF患者。腦出血組病情嚴(yán)重程度按照格拉斯哥昏迷評(píng)分(GCS)分為輕度ICH組(高GCS評(píng)分組)、重度ICH組(低GCS評(píng)分組)各13例。對(duì)照組選取同期住院經(jīng)頭顱CT/MRI證實(shí)無CNS疾病(腦血管、感染、脫髓鞘、變性疾病)、無心腦血管病史，且CSF常規(guī)檢查均在正常參考范圍內(nèi)。所有CSF樣本的采集均經(jīng)患者本人或家屬同意，并簽署知情同意書。用于本項(xiàng)目研究的臨床樣本已獲得新疆軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 MiRNA的測(cè)定采用qRT-PCR法，主要試劑及儀器包括：miRcute miRNA提取分離試劑盒(離心柱型)，miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，miRcute增強(qiáng)型熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)，外參引物(CR100-01,TIANGEN,北京)，余miRNA引物均購自天根生化科技(TIANGEN,北京)，見表1；β2-微球蛋白(β2-MG,貨號(hào)：BM7513,北京利德曼)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,貨號(hào)：05850819190,上海羅氏診斷)、乳酸(LAC,貨號(hào)：05171881190,上海羅氏診斷)、乳酸脫氫酶(LD,貨號(hào)：05169330190,上海羅氏診斷)、微量清蛋白(mAlb、貨號(hào)：04469658190,上海羅氏診斷)、NSE(貨號(hào)：12133113122,上海羅氏診斷)、S100β(貨號(hào)：03175243190,上海羅氏診斷)；Cobas全自動(dòng)熒光定量PCR分析儀Z480、Cobas e701、Cobas e602全自動(dòng)生化儀均購自羅氏公司；BIO-RED T100 PCR儀購自美國伯樂公司。

1.2.2CSF樣本收集 收集研究對(duì)象入院48 h內(nèi)CSF樣本3～5 mL，使用無菌管收集，上下輕輕顛倒混勻8次后，立即置于4 ℃或冰盒中運(yùn)送，將CSF轉(zhuǎn)移至1.5 mL無RNA酶離心管中，2 000 r/min離心10 min；將上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL無RNA酶離心管中，棄去細(xì)胞及組織沉淀；每管吸入500 μL上清進(jìn)行封裝標(biāo)記，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 miRNA成熟序列及對(duì)應(yīng)引物

1.2.3數(shù)據(jù)采集 采集患者入院初的基本病歷資料，包括姓名、年齡、既往史、初步診斷、CSF常規(guī)檢查、GCS評(píng)分、出血量(入院時(shí)CT按多田公式計(jì)算[血量(mL)=π×長(zhǎng)(cm)×寬(cm)×高(cm)/6])。收集研究對(duì)象入院48 h內(nèi)血常規(guī)、凝血四項(xiàng)、清蛋白等檢查結(jié)果。

1.2.4CSF游離miRNA提取、檢測(cè) 提取及檢測(cè)miRNA嚴(yán)格按照TIANGEN提取及檢測(cè)試劑盒試驗(yàn)流程進(jìn)行。佩戴一次性手套和口罩，所使用槍頭、EP管均為RNASE Free，其余實(shí)驗(yàn)相關(guān)器材均經(jīng)去RNA酶處理。由于CSF中miRNA含量低，提取出的RNA樣本OD260/280的測(cè)定結(jié)果不可靠，本文未列出濃度。在待檢測(cè)CSF標(biāo)本中均加入外參1 μL(cel miRNA-39,TIANGEN提供,參考Ct值范圍：6～8)為質(zhì)檢參考指標(biāo)。提?。簩?00 μL CSF樣本用miRcute miRNA提取分離試劑、氯仿、無水乙醇進(jìn)行一系列的提取及分離，最終從離心柱洗脫獲得20 μL提取物。檢測(cè)方法：每份CSF樣本提取物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合cDNA第一鏈，總反應(yīng)體系為20 μL，(反應(yīng)條件:42 ℃ 60 min逆轉(zhuǎn)錄,95 ℃ 3 min酶失活)，并使用特異性上游引物進(jìn)行擴(kuò)增，以2 μL的cDNA為模板(1∶4稀釋)，總反應(yīng)體系為20 μL(反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃變性20 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán))。以擴(kuò)增曲線和熔煉曲線綜合評(píng)估Ct的可靠性，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5CSF生化指標(biāo)的檢測(cè) 按照自動(dòng)生化儀、化學(xué)發(fā)光分析儀及相對(duì)應(yīng)的試劑盒操作流程，檢測(cè)CSF中下列生化指標(biāo)：β2-MG、AST、LAC、LD、mAlb、NSE、S100β。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 兩組在糖尿病史、吸煙史、飲酒史、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、纖維蛋白原比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而高血壓史、高脂血癥、GCS評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且ICH組中高血壓病和高脂血癥人數(shù)明顯多于對(duì)照組，見表2。

2.2CSF部分生化指標(biāo)比較

2.2.1ICH組與對(duì)照組CSF生化指標(biāo)比較 按照GCS評(píng)分將ICH組分為輕度ICH組、重度ICH組，與對(duì)照組相比，輕度ICH組、重度ICH組CSF 血糖(GLU)、血漿清除率(CL)、LD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；輕度ICH組CSF尿蛋白(PRO)、清蛋白指數(shù)(QAlb,QAlb=CAlb/SAlb)、mAlb明顯高于對(duì)照組；重度ICH組、輕度ICH組β2-MG、AST、LAC水平均明顯高于對(duì)照組；而NSE、S100β在重度ICH組、輕度ICH組高于對(duì)照組，重度ICH組高于輕度ICH組，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 病例組和對(duì)照組一般資料比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

表3 ICH組與對(duì)照組CSF生化指標(biāo)比較

注：Pa為對(duì)照組與輕度ICH組P值，Pb為對(duì)照組與重度ICH組P值，Pc為輕度ICH組與重度ICH組P值

2.2.2ICH患者出血量與CSF NSE、S100β水平相關(guān)性研究 為了研究改變的CSF NSE、S100β水平是否與腦出血量有關(guān)，筆者使用了Pearson相關(guān)系數(shù)來確定是否存在相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)CSF NSE的水平與ICH患者出血量顯著相關(guān)(r=0.86;P<0.01)，見圖1A；CSF S100β的水平與ICH患者出血量有相關(guān)性(r=0.49;P<0.05)，見圖1B。

注：A為NSE，B為S100β

圖1ICH組和對(duì)照組CSFNSE、S100β水平與出血量的相關(guān)性研究結(jié)果

2.3ICH患者CSF miRNA表達(dá)研究 本研究應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)文獻(xiàn)報(bào)道的與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的15個(gè)靶標(biāo)miRNA，探索其在腦出血疾病中的潛在診斷與病情評(píng)估價(jià)值。與對(duì)照組比較，ICH組CSF miR-124-3p、miR-146a-5p顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖2；而miR-21-5P、miR-29c-3P、miR-214-3p、miR-9-5p、miR-16-5p、miR-30e-5p、miR-221-3P、miR-125b-5P、miR-320C、miR-26b-5p、miR-7c-5P、miR-29c-3P、miR-182-5p差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與對(duì)照組比較，ICH患者CSF miR-124-3p(A)、miR-124-3p(B)水平顯著上調(diào)(*P<0.05，**P<0.01)

圖2ICH組和對(duì)照組CSF中差異表達(dá)miRNA的研究結(jié)果

2.4CSF中 NSE、S100β、miR-124-3p、miR-146a-5p診斷ICH的效能研究 CSF中 NSE、S100β、miR-124-3p、miR-146a-5p診斷ICH的AUC分別為0.931[95%置信區(qū)間(95%CI):0.857～0.892]、0.795[95%CI:0.670～0.921]、0.667[95%CI:0.512～0.822]和0.878[95%CI:0.776～0.844]。CSF中NSE、S100β兩者聯(lián)合診斷ICH的AUC為0.965，靈敏度84.6%，特異度為98.2%。當(dāng)NSE含達(dá)到0.62 ng/mL，診斷ICH的靈敏度為 80.8%,特異度為95.5%；當(dāng)S100β的水平為0.43 μg/L，診斷ICH的靈敏度為76.9%，特異度為77.3%；當(dāng) miR-124-3p相對(duì)表達(dá)量是0.45時(shí)，其診斷ICH的靈敏度為80.8%，特異度為50.1%；當(dāng)miR-146a-5p相對(duì)表達(dá)量是0.55時(shí)，其診斷ICH的靈敏度為81.8%,特異度為86.4%。見圖3。

圖3 ICH組和對(duì)照組CSF中NSE、S100β、miR-

3 討 論

腦出血是一種病因復(fù)雜、病程進(jìn)展迅速的一種疾病[7]。腦出血繼發(fā)性損傷如細(xì)胞凋亡、血腫周圍水腫、炎癥細(xì)胞、因子激活、血管內(nèi)皮損傷等嚴(yán)重危害著患者生存質(zhì)量[8]。而依賴于CSF、影像學(xué)檢查及神經(jīng)功能評(píng)估的常規(guī)檢查多反映疾病結(jié)局。CSF是直接接觸脊髓、神經(jīng)元細(xì)胞的并在腦室內(nèi)循環(huán)的體液，當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞損害后，某些神經(jīng)特異性分子的變化可在一定程度上反映受損腦組織的局部事件，是包括ICH在內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷標(biāo)志物的理想來源[9]。因此基于疾病原發(fā)灶CSF的生化標(biāo)志物或分子標(biāo)志物的檢測(cè)可直接、客觀地為臨床輔助診斷、病情評(píng)估提供參考，進(jìn)一步挖掘CSF樣本的潛在價(jià)值并為腦出血損傷機(jī)制的深入研究提供了可能。

S100β是一種主要位于中央(主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的一種酸性糖蛋白，在細(xì)胞損傷或應(yīng)激活化時(shí)釋放，能反映神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞損傷[10]。NSE是在由神經(jīng)元細(xì)胞形成的一種的水解酶，神經(jīng)元細(xì)胞膜功能與結(jié)構(gòu)受損時(shí),NSE從胞質(zhì)釋放至細(xì)胞間隙和CSF中[11]，并在CSF中有較高的濃度[12]。此外，NSE和S100β也可由一些神經(jīng)外胚層來源的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，如小細(xì)胞肺癌時(shí)血液中NSE水平可升高[13]，惡性黑色素瘤時(shí)血液S100β的水平可升高[14]，因此檢測(cè)CSF中神經(jīng)特異性蛋白更能特異、客觀地反映腦損傷程度。文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者CSF高水平NSE、S100β提示腦損傷程度嚴(yán)重且更易出現(xiàn)不良結(jié)局(腦梗死、血管痙攣和顱內(nèi)高壓)[15]，而本研究針對(duì)急性ICH病例，發(fā)現(xiàn)重度ICH組(低GCS評(píng)分組)CSF-S100β、NSE水平顯著高于輕度ICH組(高GCS評(píng)分組)，且ICH患者CSF S100β、NSE的水平與出血量均顯著正相關(guān)，表明CSF NSE、S100β水平對(duì)判斷患者病情嚴(yán)重程度具有積極意義，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)論基本一致?；A(chǔ)研究已證實(shí)NSE、S100β水平在腦損傷自適應(yīng)調(diào)節(jié)后升高并參與神經(jīng)損傷后的修復(fù)[16]，是具有應(yīng)用前景的腦損傷標(biāo)志物。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)CSF NSE、S100β對(duì)ICH的診斷效能，筆者又將NSE與S100β進(jìn)行ROC分析，明確了兩者聯(lián)合檢測(cè)可提高靈敏度至84.6%，提高特異度至98.2%，因此CSF NSE、S100β聯(lián)合檢測(cè)更能有效輔助診斷ICH及評(píng)估腦損傷程度。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA加工成熟的，僅由20～24個(gè)核苷酸組成的短鏈RNA，其作為調(diào)節(jié)劑在CNS相關(guān)疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。不斷有研究揭示腦出血后miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變并在一系列繼發(fā)損傷中扮演著重要的角色。IWUCHUKWU等[18]通過檢測(cè)ICH確診患者CSF中的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)211個(gè)差異表達(dá)miRNA，高表達(dá)的miRNA包括：miR-204-5p(2 075倍)、miR-125b-5p(108倍)、miR-9-5p(299倍)、miR-338-3p(146倍)、miR-187-3p(21倍)、miR-9-3p(299倍)。S?RENSEN等[19]研究發(fā)現(xiàn)ICH患者CSF中部分miRNA的水平明顯高于血漿，而調(diào)控炎癥相關(guān)基因的miRNA大量減少表明其可能受到系統(tǒng)調(diào)節(jié)影響。本研究針對(duì)ICH病例，選擇了文獻(xiàn)報(bào)道的與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的15個(gè)靶標(biāo)miRNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ICH患者CSF miR-124-3p、miR-146a-5p表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。研究表明，miR-124-3p過表達(dá)后可抑制神經(jīng)毒性，包括減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，并可在體外減弱甲基苯基吡啶碘化(MPP)誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[20]。而miR-146a與ICH誘導(dǎo)的腦水腫發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)過程有關(guān)，包括先天免疫反應(yīng)、白細(xì)胞激活、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)和平滑肌細(xì)胞增殖[21]。因此，miR-124-3p、miR-146a-5p與出血所致腦組織損傷的病理生理過程是相關(guān)的，支持本研究的結(jié)果，其可作為診斷腦出血及評(píng)估腦損傷的生物標(biāo)志物。同時(shí)也為miRNA參與腦損傷相關(guān)的機(jī)制研究提供了新的方向。

4 結(jié) 論

ICH后CSF蛋白水平(NSE、S100β)和基因水平(miR-124-3p、miR-146a-5p)標(biāo)志物的檢測(cè)可用于ICH的輔助診斷，NSE、S100β不僅可以反映腦組織損傷程度，也可用來評(píng)估ICH 出血嚴(yán)重程度。與此同時(shí)，本研究也具有一定的臨床局限性，如CSF樣本不易獲取、CSF采集時(shí)機(jī)差異、miRNA水平個(gè)體差異、入組病例數(shù)較少等，仍需多中心、大樣本加以驗(yàn)證。