張 敏，張俊平，楊美娟，李凌霄，郜莉娜，沈明輝，尤崇革△

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，甘肅蘭州 730030；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅蘭州 730030)

高分辨熔解曲線(xiàn)(HRM)作為一種新興的分子診斷技術(shù)，其不受突變位點(diǎn)和突變類(lèi)型的限制，特異度和靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，目前已被廣泛地用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域研究[1-5]。由于HRM檢測(cè)的高靈敏性，其對(duì)核酸質(zhì)量的要求也相對(duì)較高。磁固相萃取技術(shù)(MSPE)由于其快速、高效以及易于自動(dòng)化的特點(diǎn)引起了越來(lái)越多的關(guān)注[6-10]。在MSPE中，避免了產(chǎn)生可能導(dǎo)致核酸降解的離心步驟，減少物理或化學(xué)因素對(duì)核酸的損害，同時(shí)，作為固相吸附劑的磁性顆粒(MNP)可以通過(guò)施加外部磁場(chǎng)而被很容易地除去[11-12]。為此，本研究制備并建立了3種基于磁珠的核酸提取方法，分別以3種突變位點(diǎn)及突變類(lèi)型(rs12641369G>A、rs3114018C>A、rs2302515C>G)為例，探討其對(duì)PCR-HRM檢測(cè)的影響，并評(píng)價(jià)檢驗(yàn)性能。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 40例全血標(biāo)本來(lái)自蘭州大學(xué)第二醫(yī)院體檢中心健康人群，平行采用天根公司的全血基因組DNA試劑盒、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4提取300 μL全血。

1.2主要試劑與儀器 六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、無(wú)水乙酸鈉(NaAc)、乙二醇、聚乙二醇10000、聚乙二醇6000和無(wú)水氯化鈉(天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng))，正硅酸乙酯、殼聚糖(天津科密歐化學(xué)試劑公司)，緩沖液CL(北京天根公司)，洗脫液(日本富士公司)，Taq DNA 聚合酶和SYTO13染料(美國(guó)Life Technologies公司)，dNTP(美國(guó)Invitrogen公司)，Rotor-Gene Q PCR儀(德國(guó)QIAGEN公司)，Nano-drop 2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermal Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1磁珠制備 首先采用水熱法制備了羧基改性磁性Fe3O4納米粒子。FeCl3·6H2O(1.35 g)溶于乙二醇(40 mL)，借助于超聲波處理形成澄清溶液；再將NaAc(3.6 g)和聚乙二醇10000(1.0 g)加入到溶液中，劇烈攪拌混合物直至獲得均勻的深黃色溶液；將該溶液放入聚四氟乙烯高壓反應(yīng)器中，在200 ℃條件下加熱48 h；產(chǎn)物用乙醇和水洗滌數(shù)次，并在60 ℃的氮?dú)鈼l件下干燥10 h備用，最后得到Fe3O4磁性納米粒子。取250 mg Fe3O4顆粒加入30 mL乙醇超聲30 min；向燒杯中加入30 mL乙醇、60 mL乙醇胺及5.28 g超純水，并攪拌均勻；將上述液體與Fe3O4顆粒溶液混勻后放入三口燒瓶，邊攪拌邊滴加2 mL正硅酸乙酯(500 r/min)，再將轉(zhuǎn)速調(diào)至800 r/min，機(jī)械攪拌6 h，最后洗滌干燥，得到SiO2@Fe3O4。1 g Fe3O4顆粒加入一定量超純水超聲1 h，再加入100 mL 1%殼聚糖溶液(1%醋酸溶液稀釋)機(jī)械攪拌24 h，取150 mg上述顆粒加入4 mL 2.5%戊二醛溶液(0.2 mol/L磷酸鹽溶液配制)，200 r/min機(jī)械攪拌5 h，洗滌干燥得到CTA@ Fe3O4。

1.3.2核酸提取 柱提法核酸提取按照天根公司試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。向300 μL EDTA-K2抗凝血液中加入300 μL無(wú)菌去離子水以破壞紅細(xì)胞膜，混合數(shù)次后，將混合液以12 000 r/min離心3 min，棄去上清液；在剩余的沉淀中加入緩沖液CL(300 μL)，混合數(shù)次；將混合物以12 000 r/min離心1 min，棄去上清液；制備150 mL蛋白酶K-緩沖液FG混合液(1∶100)并加入到沉淀中，倒轉(zhuǎn)幾次，直至沉淀物完全溶解；將離心管放入65 ℃金屬浴中溫浴10 min；向上述裂解液中加入300 μL結(jié)合溶液(20%PEG，4 mol/L氯化鈉，pH=2.0)，隨后加入40 ng SiO2@Fe3O4/CTA2@Fe3O4/Fe3O4；室溫下靜置10 min；在磁力分離架上分離結(jié)合物，棄去上清液。結(jié)合物用70%乙醇溶液洗滌2次并在室溫下干燥。加入50 μL洗脫液并在室溫下溫育10 min。最后磁分離，將洗脫液轉(zhuǎn)移至新管。

1.3.3DNA質(zhì)量評(píng)價(jià) DNA提取產(chǎn)物中取1 μL用超微量蛋白核酸檢測(cè)儀測(cè)定濃度、A260及A280，計(jì)算得率(濃度×洗脫液體積)和純度(A260/A280)。

1.3.4引物設(shè)計(jì)與合成 使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，并使用在線(xiàn)工具UNAfold和uMelt進(jìn)行引物驗(yàn)證，引物由南京金思特(GenScript)科技有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 3個(gè)SNP位點(diǎn)的引物信息表

1.3.5PCR-HRM基因分型 反應(yīng)體系10 μL，包括1 μL DNA 樣本，10×PCR Buffer 1 μL，0.08 μL Taq DNA 聚合酶(濃度5 U/μL)，10 mmol /L dNTP 0.2 μL，20 μmol/L引物各0.25 μL，10×SYTO 13染料0.5 μL，50 mmol/L的MgCl20.05 μL，最后加water-DEPC至10 μL。rs12641369和rs3114018反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共15個(gè)循環(huán)；變性95 ℃ 10 s，退火56 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共25個(gè)循環(huán)。rs2302515反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。隨后進(jìn)行HRM分析，條件為95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲線(xiàn)溫度區(qū)間為75～85 ℃，分辨率為每梯度0.2 ℃，通過(guò)熔解曲線(xiàn)峰型的改變進(jìn)行基因分型。

1.3.6檢驗(yàn)性能的評(píng)價(jià) 為評(píng)價(jià)靈敏度與特異度，特定義雜合和純合突變基因型為陽(yáng)性，野生基因型為陰性。靈敏度為真陽(yáng)性占真陽(yáng)性與假陰性之和的百分比，特異度為真陰性占假陽(yáng)性與真陰性之和的百分比。重復(fù)性采用批內(nèi)10次重復(fù)評(píng)價(jià)，再現(xiàn)性采用批間重復(fù)10次。

2 結(jié) 果

2.1DNA提取質(zhì)量比較 如表2所示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示以離心柱法為對(duì)照，SiO2@ Fe3O4法得率與離心柱法相當(dāng)，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CTA@Fe3O4法及Fe3O4法核酸提取得率均較離心柱法低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；5種方法提取核酸的純度(A260/A280≈1.80)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PDA@Fe3O4法和SiO2@ Fe3O4法均具有良好的核酸提取質(zhì)量。

注：從左到右依次為離心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線(xiàn)圖(上)和求導(dǎo)熔解曲線(xiàn)圖(下)；最右側(cè)為rs12641369的測(cè)序驗(yàn)證圖

圖15種核酸提取方法rs12641369的批量PCR-HRM熔解曲線(xiàn)圖

2.2靈敏度和特異度 在40例樣本中rs12641369、rs3114018和rs2302515有2例標(biāo)本由于熔解峰飄移，不能直接基因分型，其余均可直接分型(如圖1～3)。這2例樣本后經(jīng)與已知純合型樣本混熔和重新檢測(cè)后均能明確分型：所有樣本檢測(cè)結(jié)果與Sanger測(cè)序結(jié)果一致，4種核酸提取結(jié)合HRM方法在本次研究中靈敏度和特異度達(dá)到100%。

表2 4種核酸提取方法核酸質(zhì)量的比較

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)

注：從左到右依次為離心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線(xiàn)圖(上)和求導(dǎo)熔解曲線(xiàn)圖(下)；最右側(cè)為rs3114018的測(cè)序驗(yàn)證圖

圖25種核酸提取方法rs3114018的批量PCR-HRM熔解曲線(xiàn)圖

注：從左到右依次為離心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線(xiàn)圖(上)和求導(dǎo)熔解曲線(xiàn)圖(下)；最右側(cè)為rs2302515的測(cè)序驗(yàn)證圖

圖35種核酸提取方法rs2302515的批量PCR-HRM熔解曲線(xiàn)圖

2.3重復(fù)性和再現(xiàn)性 在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，離心柱法、SiO2@Fe3O4法、CTA@Fe3O4法及Fe3O4法在rs12641369位點(diǎn)基因型GG對(duì)應(yīng)熔解曲線(xiàn)的Tm的CV分別為0.6%、0.6%、0.8%和1.2%；t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型和純合型Tm值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在rs3114018位點(diǎn)基因型CC的TmCV分別為0.4%、0.8%、0.5%和1.3%；t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型和純合型Tm值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在rs2302515位點(diǎn)基因型CC的TmCV分別為0.7%、0.8%、0.5%和1.5%；t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型和純合型Tm值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由于rs2302515C>G的純合型與野生型Tm值極為接近，本研究通過(guò)車(chē)輪式混溶的方法區(qū)分了所有樣本的基因型。再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)也顯示，所有核酸提取方法及SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的熔解曲線(xiàn)Tm值的CV均在0.4%～1.5%，盡管批間的熔解曲線(xiàn)有輕微的波動(dòng)，但不影響基因正確分型。

3 討 論

HRM技術(shù)和其他SNP基因分型方法(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法、Taqman熒光探針?lè)ǖ?相比，不需要設(shè)計(jì)序列特異度探針，不需要PCR后處理，全程閉關(guān)操作，減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還具有檢測(cè)高效快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)[13]。但影響HRM檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素很多[14]，除PCR本身反應(yīng)體系外，往往忽視標(biāo)本核酸模板提取對(duì)結(jié)果的影響，且較少系統(tǒng)評(píng)價(jià)其對(duì)檢驗(yàn)性能的影響。目前，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)用磁性納米顆粒提取基因組DNA，同時(shí)，市面上所銷(xiāo)售的磁珠法核酸分離試劑盒，大多數(shù)為國(guó)外產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，很難得到廣泛應(yīng)用[15]。本研究對(duì)3種自建的基于磁珠法的PCR-HRM檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了方法學(xué)的性能評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，與測(cè)序法比較，該方法的對(duì)3個(gè)位點(diǎn)(rs12641369G>A、rs3114018C>A、rs2302515C>G)分型的靈敏度和特異度均達(dá)到100%。2例樣本在檢測(cè)時(shí)存在擴(kuò)增曲線(xiàn)異常偏離群體，原因可能與模板操作失誤或模板質(zhì)量有關(guān)。重復(fù)性與再現(xiàn)性結(jié)果表明離心柱法與磁珠法結(jié)合PCR-HRM進(jìn)行基因分型均具有較好的批內(nèi)精密度，特別是G>A及C>A突變類(lèi)型能夠通過(guò)熔解曲線(xiàn)峰型清楚地區(qū)分野生型與純合突變型。盡管不同修飾的磁珠提取效果各有差異，但HRM技術(shù)對(duì)檢測(cè)模板質(zhì)量的輕微波動(dòng)可以耐受，在檢測(cè)過(guò)程中仍可保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

本研究制備的3種磁性納米顆粒(SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4、Fe3O4)均可用于核酸提取及PCR-HRM檢測(cè)，但在提取核酸得率及檢驗(yàn)性能方面，SiO2@Fe3O4更佳；磁珠提取結(jié)合PCR-HRM方法的建立有效縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)省了工作成本，為后續(xù)的分子生物學(xué)研究提供了理論依據(jù)。另外，本研究所制備的磁珠有望實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化核酸提取，從而降低手工操作帶來(lái)的污染及誤差。