熊 丹，杜 勇，張 華，武 薇，莫紅梅，張秀明△

(1.深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001；2.上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 200433；3.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部，廣東廣州 510060)

鼻咽癌是來源于人類鼻咽上皮細(xì)胞惡性程度較高的頭頸部腫瘤，北美和其他西方國家的白種人每年的發(fā)病率低于1/100 000；然而，在中國南方其年發(fā)病率可高達(dá)25/100 000～30/100 000，其中又以廣東最為常見[1]。由于具有顯著的地方性，鼻咽癌又被稱為“廣東癌”[2]。在中國的華南等高發(fā)區(qū)，鼻咽癌的組織類型97%以上為未分化癌(WHO Ⅲ型)[3]。EB病毒感染、環(huán)境致癌因素以及抑癌基因和原癌基因的突變等多因素、多步驟共同參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程[1]。EB病毒屬人類γ-皰疹病毒亞科淋巴潛隱病毒屬，1997年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(LARC)的報(bào)告中已將EB病毒列為Ⅰ類致癌原[4]。EB病毒在體內(nèi)主要感染B淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞，與伯基特淋巴瘤、霍奇金病、胃癌和鼻咽癌等腫瘤密切相關(guān)[5]。

非肌肉肌漿球蛋白重鏈ⅡA(NMHC-ⅡA)由位于22q11.2染色體上的全長1 960個(gè)氨基酸的MYH9基因編碼[6]，這是一種廣泛表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)的肌球蛋白，參與多種過程，包括細(xì)胞內(nèi)化學(xué)機(jī)械力的產(chǎn)生和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的移位[7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)NMHC-ⅡA與病毒糖蛋白gH/gL相互作用介導(dǎo)EB病毒感染鼻咽上皮細(xì)胞[8]，NMHC-ⅡA是EB病毒進(jìn)入鼻咽上皮細(xì)胞的重要細(xì)胞分子。因此制備針對(duì)NMHC-ⅡA為靶點(diǎn)的抗EB病毒感染的中和抗體，對(duì)于鼻咽癌的靶向治療具有重要意義。本文應(yīng)用兔多克隆抗體制備技術(shù)，制備抗NMHC-ⅡA的特異性抗體，為進(jìn)一步進(jìn)行鼻咽癌的分子靶向治療和研究NMHC-ⅡA在鼻咽癌中扮演的角色奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 收集3例鼻咽炎增生組織(NPN-1、NPN-2、NPN-3，病理診斷為炎癥增生組織)和4例鼻咽癌組織(NPC-1、NPC-1、NPC-3、NPC-4，病理診斷為腫瘤組織)。4株原代鼻咽上皮細(xì)胞(N01、N02、N03、N04)、永生化的NP69細(xì)胞和BMI1/NPECs在無血清的培養(yǎng)基(KSFM)中培養(yǎng)(InvitroGen，17005～075)；鼻咽癌細(xì)胞株(C666-1、HK1、SUNE1、SUNE2、CNE1、CNE2)、CNE2-EBV、HNE1-EBV、HK1-EBV和Akata(EBV-eGFP)培養(yǎng)在5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。EBV-eGFP的制備如文獻(xiàn)[9]報(bào)道，用0.8%羊抗人IgG交聯(lián)Akata (EBV-eGFP)細(xì)胞表面IgG蛋白，促使EB病毒從潛伏期進(jìn)入裂解期，從而使病毒顆粒釋放。重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C (amino acids 1665-1960;UniProt entry P35579)由本室構(gòu)建并保存。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本大耳白兔，購買于具有“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證”資質(zhì)的武漢市萬千佳興生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑 7900HT Fast Real-time PCR 系統(tǒng) (Applied Biosystems,USA)，電泳儀，水平電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)(SynGene)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5810,Centrifuge 5417R,Eppendorf)，超純水系統(tǒng)(Millipore)，磁力攪拌器，分析天平和 pH 計(jì)(Mettler Toledo)，漩渦振蕩儀(Scientific Industries)，超凈工作臺(tái)(蘇凈)，培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，普通光學(xué)顯微鏡(COIC,XSZ-H)，倒置相差顯微鏡(COIC XDS-1B)，流式細(xì)胞儀(FACS Diva Option,Becton Dickinson,Mountain View,CA)。Trizol試劑(Invitrogen，Grand Island，NY)，逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成試劑盒(Fermentas，St Leon-Rot，德國)，卡那霉素，谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Glutathione-Sepharose beads，GE公司)，兔IgG(R&D Systems公司)，anti-NMHC-ⅡA兔多克隆抗體 (英國Abcam公司)，GAPDH 抗體和β-actin 抗體(中國上?？党晒?。

1.3方法

1.3.1重組蛋白的表達(dá)、鑒定和純化 將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C (amino acids 1665-1960;UniProt entry P35579)進(jìn)行Bam HI和EcoRI雙酶切鑒定，得到的小片段，進(jìn)行測序和比對(duì)。將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C和對(duì)照質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，得到重組蛋白表達(dá)菌株，然后加入500 μM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h后，離心收集沉淀。在沉淀中加入細(xì)菌裂解液，超聲破碎后，離心，收集上清，用SDS-PAGE的方法檢測目的蛋白。用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Glutathione-Sepharose beads，GE公司)純化NMHC-ⅡA重組蛋白，參照產(chǎn)品說明書操作。

1.3.2多克隆抗體的制備、純化和效價(jià)測定 以日本大耳白兔為免疫動(dòng)物，免疫前取1 mL兔血清為對(duì)照組。將濃縮后的NMHC-ⅡA蛋白作為免疫原以1.0毫克/只的劑量通過背部及皮下多點(diǎn)注射到2只日本大耳白兔。首次免疫與加強(qiáng)免疫總共4次，末次免疫7 d后對(duì)日本大耳白兔進(jìn)行頸動(dòng)脈取血，分別收集2只日本大耳白兔免疫后的血清各30 mL和12 mL，然后進(jìn)行純化。期間，采用間接ELISA的方法檢測從日本大耳白兔耳緣靜脈取血中該抗體的效價(jià)。采用SDS-PAGE檢測純化后的兔抗NMHC-ⅡA抗體濃度。

1.3.3Real-time PCR和Western-Blot檢測 用Trizol試劑(Invitrogen，Grand Island，NY)從4株原代鼻咽上皮細(xì)胞、3株永生化鼻咽上皮細(xì)胞株、6株鼻咽癌細(xì)胞株、3例鼻咽炎增生組織和4例鼻咽癌組織中提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成試劑盒(Fermentas，St Leon-Rot，德國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Real-time PCR方法檢測鼻咽細(xì)胞株和組織中NMHC-ⅡA的mRNA水平的表達(dá)情況。NMHC-ⅡA、GAPDH的引物序列及Real-time PCR反應(yīng)條件同文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。Western-Blot檢測方法參照文獻(xiàn)[11]采用的抗體包括anti-NMHC-ⅡA兔多克隆抗體(英國Abcam公司)、制備的anti-NMHC-ⅡA兔多克隆抗體、GAPDH抗體和β-actin抗體(中國上?？党晒?，以GAPDH和β-actin抗體為內(nèi)參照。

1.3.4抗體阻斷試驗(yàn) 用制備的不同濃度的多克隆NMHC-ⅡA抗體(100、50和25 μg/mL)和100 μg/mL的對(duì)照IgG(購買于R&D Systems公司)在4 ℃預(yù)處理細(xì)胞1 h，不除去抗體，然后在37 ℃條件，EB病毒感染細(xì)胞3 h，接著用1×SA洗2次，加1 mL的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用流式細(xì)胞儀檢測24 h內(nèi)EB病毒感染細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

1.3.5流式細(xì)胞儀分析 為檢測EB病毒感染細(xì)胞的百分率和平均熒光強(qiáng)度，細(xì)胞在感染后24 h內(nèi)被胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后采用流式細(xì)胞儀(FACS Diva Option;Becton Dickinson)進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1NMHC-ⅡA mRNA在鼻咽細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的鼻咽上皮細(xì)胞、永生化鼻咽上皮細(xì)胞株、鼻咽癌細(xì)胞株、鼻咽炎增生組織和鼻咽癌組織在轉(zhuǎn)錄水平上都表達(dá)NMHC-ⅡA。4株原代培養(yǎng)的鼻咽上皮細(xì)胞NMHC-ⅡA的mRNA表達(dá)比鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)都高，除了C666-1外。永生化鼻咽上皮細(xì)胞株中，NP69的表達(dá)較低，另外2株永生化細(xì)胞株比較高。在鼻咽癌細(xì)胞株中，C666-1的NMHC-ⅡA的mRNA表達(dá)最高，其次是CNE2。與3例鼻咽炎增生組織相比，4例鼻咽癌組織中，2例鼻咽癌組織中NMHC-ⅡA的mRNA表達(dá)水平較高，另外2例相差不大(圖1)。

注：A表示NMHC-ⅡA mRNA在原代培養(yǎng)鼻咽上皮細(xì)胞、永生化鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)；B表示NMHC-ⅡA mRNA在鼻咽炎增生組織和鼻咽癌組織中廣泛表達(dá)

圖1NMHC-ⅡAmRNA在鼻咽細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)

2.2NMHC-ⅡA-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體的鑒定及NMHC-ⅡA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C 進(jìn)行雙酶切后得到小片段的大小為1 000 bp左右，經(jīng)過測序和比對(duì)，確定其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中MYH9基因序列一致(圖2A)。含有pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C和pGEX-4T-1/GST重組質(zhì)粒的E．coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量為60×103左右處有明顯的蛋白誘導(dǎo)條帶，為GST-NMHC-ⅡA的重組蛋白；相對(duì)分子質(zhì)量為25×103左右處有明顯的蛋白誘導(dǎo)條帶，為GST蛋白(圖2B)。將原核表達(dá)產(chǎn)物裂解后用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠進(jìn)行NMHC-ⅡA重組蛋白純化，通過SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，初步純化了GST-NMHC-ⅡA的融合蛋白(圖2C)，進(jìn)一步大批量的培養(yǎng)細(xì)菌并純化蛋白，得到了大于2 mg，濃度為1.0 mg/mL的純化蛋白，經(jīng)免疫印跡鑒定，為GST-NMHC-ⅡA的融合蛋白(圖2D)。

注：圖A為用Bam HI和EcoRI 對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C 進(jìn)行雙酶切的鑒定，M為DNA DL15000 marker和DNA DL2000 marker，1為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C，2為用Bam HI和EcoRI 對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/GST-NMHC-ⅡA-C 進(jìn)行酶切的結(jié)果；圖B為GST-NMHC-ⅡA和GST蛋白的表達(dá)，M為Marker，1為GST-NMHC-ⅡA的重組蛋白，2為GST蛋白；圖C為GST-NMHC-ⅡA和GST蛋白的純化，M為Marker，1為GST-NMHC-ⅡA的重組蛋白，2為GST蛋白；圖D為大批量制備GST-NMHC-ⅡA重組蛋白的鑒定

圖2NMHC-ⅡA-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體的鑒定及NMHC-ⅡA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化

2.3兔抗NMHC-ⅡA多克隆抗體的制備及效價(jià)測定 將NMHC-ⅡA蛋白作為免疫原免疫日本大耳白兔，將免疫后的血清通過間接ELISA方法測得抗NMHC-ⅡA血清的效價(jià)均為1 000 000(圖3A)。采用間接ELISA方法檢測來源于1號(hào)日本大耳白兔的血清、洗脫液和純化抗體的效價(jià)分別是1∶100 000、1∶500和1∶100 000。來源于2號(hào)日本大耳白兔的血清、洗脫液和純化抗體的效價(jià)分別是1∶1 000 000、1∶500和1∶1 000 000(圖3B)。SDS-PAGE檢測純化后的兔抗NMHC-ⅡA抗體濃度分別是600 μg/mL和1.35 mg/mL(圖3C)。

2.4采用制備的兔抗NMHC-ⅡA抗體檢測鼻咽癌細(xì)胞株和永生化鼻咽上皮細(xì)胞株中NMHC-ⅡA蛋白的表達(dá) 采用制備得到的1號(hào)抗體(編號(hào)為S3633-1)和2號(hào)抗體(編號(hào)為S3633-2)檢測鼻咽癌細(xì)胞株中NMHC-ⅡA的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)2株抗體能檢測到鼻咽癌細(xì)胞株中NMHC-ⅡA的表達(dá)(圖4A)。與商業(yè)化NMHC-ⅡA抗體相比，制備的抗體也能檢測到永生化鼻咽上皮細(xì)胞株中NMHC-ⅡA蛋白的表達(dá)；商業(yè)化的抗體和制備的抗體的使用濃度均為1∶1 000，表明制備的抗體有良好的特異度和靈敏度(圖4B)。采用Western-blot方法檢測鼻咽癌細(xì)胞株和穩(wěn)定表達(dá)EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞株中NMHC-ⅡA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)EB病毒的感染并不影響NMHC-ⅡA蛋白的表達(dá)(圖4C)。

注：圖A為采用ELISA方法檢測來源于2只日本大耳白兔的抗血清抗體的效價(jià)，1為1號(hào)日本大耳白兔，2為2號(hào)日本大耳白兔；圖B為采用ELISA方法檢測2株純化抗體的效價(jià)，1為1號(hào)日本大耳白兔，2為2號(hào)日本大耳白兔，a為血清；b為洗脫液；c為純化抗體；圖C為SDS-PAGE檢測純化后的NMHC-ⅡA抗體濃度，1為來源于1號(hào)日本大耳白兔的純化抗體，2為來源于2號(hào)日本大耳白兔的純化抗體

圖3兔抗NMHC-ⅡA多克隆抗體的效價(jià)及特異性檢測

注：圖A為采用1號(hào)抗體(編號(hào)為S3633-1)和2號(hào)抗體(編號(hào)為S3633-2)檢測鼻咽癌細(xì)胞株中NMHC-ⅡA的蛋白表達(dá)情況；圖B為采用2號(hào)抗體(編號(hào)為S3633-2)和商業(yè)化抗體(編號(hào)為AB24762)檢測永生化鼻咽上皮細(xì)胞中NMHC-ⅡA的蛋白表達(dá)情況；圖C為采用2號(hào)抗體(編號(hào)為S3633-2)檢測鼻咽癌細(xì)胞株和用EB病毒感染鼻咽癌細(xì)胞株建立的穩(wěn)定表達(dá)EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞株中NMHC-ⅡA的蛋白表達(dá)情況

圖4制備的兔抗NMHC-ⅡA抗體檢測鼻咽癌細(xì)胞株和永生化鼻咽上皮細(xì)胞株中NMHC-ⅡA蛋白的表達(dá)

注：A為熒光顯微鏡觀察EB病毒或者腺病毒感染預(yù)先與不同濃度的中和抗體NMHC-ⅡA孵育后永生化鼻咽上皮細(xì)胞的代表性圖片；B、C為EB病毒或者腺病毒感染預(yù)先與不同濃度的中和抗體NMHC-ⅡA孵育后永生化鼻咽上皮細(xì)胞的感染效率及柱狀圖；數(shù)據(jù)顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=2)，以對(duì)照組IgG感染效率為100%，其余的與其比較所得到的值；*P<0.05，**P<0.01

圖5NMHC-ⅡA中和抗體抑制EB病毒感染的效率圖

2.5NMHC-ⅡA抗體可以有效地抑制EB病毒的感染 研究NMHC-ⅡA在EB病毒感染鼻咽癌上皮細(xì)胞中是否發(fā)揮作用。分別將25、50、100 μg/mL制備的多克隆抗體NMHC-ⅡA預(yù)先與永生化鼻咽細(xì)胞株NPEC2-BMI1孵育后，然后通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)兔抗NMHC-ⅡA多克隆抗體可以降低EB病毒的感染效率，并呈劑量依賴性。100 μg/mL劑量的多克隆抗體減少EB病毒的感染效率達(dá)54.84%。相反，該抗體對(duì)腺病毒的感染并沒有影響。無論是顯微鏡觀察GFP的表達(dá)分布和流式檢測EB病毒的感染效率，結(jié)果均一致(圖5)。

3 討 論

NMHC-ⅡA在卡波氏肉瘤病毒(KSHV)[11]和人類單純皰疹病毒(HSV-1)[12]進(jìn)入宿主細(xì)胞發(fā)揮著非常重要的作用。NMHC-ⅡA是HSV-1感染上皮細(xì)胞的受體，并且發(fā)現(xiàn)NMHC-ⅡA有利于HSV-1與上皮細(xì)胞的融合[12]。文獻(xiàn)報(bào)道NMHC-ⅡA是豬繁殖和呼吸綜合征(PRRS)病毒感染的重要細(xì)胞因子，重組NMHC-ⅡA蛋白C末端結(jié)構(gòu)域(命名為PRA)通過與病毒糖蛋白5直接相互作用阻斷豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)的內(nèi)化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PRRSV與可溶性PRA蛋白的預(yù)孵育對(duì)病毒有抑制作用，并呈劑量依賴性。PRA還具有抑制PRRSV基因型1和2的不同菌株感染的廣譜能力[13]。筆者前期研究表明EB病毒gH/gL與NMHC-ⅡA相互作用促進(jìn)EB病毒有效進(jìn)入上皮細(xì)胞，并且抑制內(nèi)源性NMHC-ⅡA的表達(dá)可減少EB病毒的結(jié)合[8]，說明內(nèi)源性NMHC-ⅡA在EB病毒感染永生化鼻咽上皮細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用。筆者前期通過抗體阻斷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制備的多克隆抗體NMHC-ⅡA可以降低EB病毒的感染效率，并呈劑量依賴性，但對(duì)腺病毒的感染沒有影響[8]。本研究采用不同的劑量也得到了相同的結(jié)果，同樣采用的是重組蛋白C末端區(qū)域，進(jìn)一步表明內(nèi)源性NMHC-ⅡA在EB病毒感染永生化的鼻咽上皮細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用。能阻斷NMHC-ⅡA與EB病毒gH/gL相互作用的抑制劑可能阻止EB病毒進(jìn)入或阻止永生化的鼻咽上皮細(xì)胞向鼻咽癌轉(zhuǎn)化。因此制備針對(duì)NMHC-ⅡA為靶點(diǎn)的抗EB病毒感染的中和抗體，對(duì)于鼻咽癌的靶向及其抗病毒治療具有重要意義。

采用Akata EBV(+)細(xì)胞制備的EB病毒攜帶綠色熒光蛋白，從而為檢測病毒感染細(xì)胞提供方便。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)EB病毒感染永生化鼻咽上皮細(xì)胞形成球形細(xì)胞后，與沒感染前，NMHC-ⅡA表達(dá)無明顯變化[8]。筆者采用高滴度的EB病毒感染鼻咽癌細(xì)胞株，然后用G418篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞株。采用Western-blot方法檢測穩(wěn)定表達(dá)EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞株中NMHC-ⅡA蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，NMHC-ⅡA蛋白的表達(dá)沒有增加，表明EB病毒的感染并不能影響NMHC-ⅡA蛋白的表達(dá)，與筆者前期研究一致。

最近，NMHC-ⅡA在腫瘤細(xì)胞中的作用越來越受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-647通過靶向調(diào)控SRF-MYH9軸，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。一項(xiàng)研究表明長鏈非編碼RNA PTCSC2與MYH9蛋白結(jié)合，更易發(fā)生甲狀腺癌[15]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)S100A4-Myh9軸通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16]。筆者研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的NMHC-ⅡA可以作為預(yù)示膀胱癌病人不良預(yù)后的分子標(biāo)志物，沉默內(nèi)源性NMHC-ⅡA的表達(dá)后能降低膀胱癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力[10]。然而，在頭頸部鱗癌中，NMHC-ⅡA被確認(rèn)為腫瘤抑制因子[17]。文獻(xiàn)報(bào)道NMHC-ⅡA S1943位點(diǎn)的磷酸化有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)NMHC-ⅡA mRNA在原代培養(yǎng)、永生化鼻咽上皮細(xì)胞株、鼻咽癌細(xì)胞株及鼻咽組織、鼻咽癌組織中都有表達(dá)，并且NMHC-ⅡA蛋白在原代培養(yǎng)、永生化鼻咽上皮細(xì)胞株和鼻咽癌細(xì)胞株中都有表達(dá)，表明這種蛋白廣泛存在于鼻咽上皮細(xì)胞，該蛋白及其磷酸化水平在鼻咽癌中發(fā)揮的作用又是如何，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

筆者成功實(shí)現(xiàn)了人源NMHC-ⅡA蛋白的重組表達(dá)、純化及高效價(jià)多克隆抗體的制備。該多克隆抗體能識(shí)別細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的NMHC-ⅡA蛋白。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)NMHC-ⅡA多克隆抗體可以有效地抑制EB病毒在永生化鼻咽上皮細(xì)胞中的感染，為進(jìn)一步研究NMHC-ⅡA相關(guān)功能奠定了重要基礎(chǔ)。