施昀 李王平 韓璐瑤 高永恒 王虎 金發(fā)光

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安710038

近年來,由于抗生素的不恰當(dāng)使用或者濫用已經(jīng)導(dǎo)致了多種耐藥菌的產(chǎn)生[1],其中致病菌對β-內(nèi)酰胺類藥物所產(chǎn)生的耐藥性已成為世界性問題[2-3]?？股卦跉?xì)菌的過程中可使脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等致炎因子大量釋放入血,進(jìn)一步加重對機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞。因此,探索一種新的抗菌策略成為目前亟待解決的問題[1]?？咕臑橐活愑缮锩庖呦到y(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的帶正電荷及具備疏水性和雙親性的小分子活性多肽,具有廣譜的抗微生物活性[4-5],是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞 (NR8383)構(gòu)建體外炎癥模型,觀察細(xì)胞活性及凋亡情況,并檢測腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6 等炎癥因子及核因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)蛋白的表達(dá),進(jìn)而評價(jià)LL37對巨噬細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng),探討其抗炎作用的具體分子機(jī)制以期從細(xì)胞水平理解LL37在炎癥疾病中的應(yīng)用價(jià)值,為臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NR8383細(xì)胞購自齊氏生物科技有限公司;DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone公司;LPS購自美國Sigma公司;CCK8細(xì)胞檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧波生物科技有限公司;TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒購自中國Neobioscience公司;P-NF-κB p65 抗體購自美國Abcam公司;LL37和 LL37中和抗體購自美國Hycult Biotech公司;流式細(xì)胞儀為BD Accuri C6(美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組干預(yù) NR8383細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。將細(xì)胞隨機(jī)分為4 組：對照組給予正常培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h,LPS 組給予含1 mg/L LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h,LL37組給予含10 mg/L LL37 的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h,實(shí)驗(yàn)組在1 mg/L LPS刺激的基礎(chǔ)上,同時(shí)加入10 mg/L LL37培養(yǎng)12 h,干預(yù)組在實(shí)驗(yàn)組基礎(chǔ)上加入10 mg/L的LL37中和抗體。

1.2.2 CCK8測定巨噬細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期NR8383細(xì)胞以每孔2×105接種于96孔板中,培養(yǎng)箱中孵育24 h。次日,棄上清,按 “1.2.1”進(jìn)行分組及給藥處理,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白孔,每孔培養(yǎng)液為100μl。37℃孵育12 h后,加入CCK8 10μl,37 ℃繼續(xù)孵育4 h后在450 nm處測量吸光度值 (A450 nm)。細(xì)胞活力 (%)=(給藥組A450 nm-空白A450 nm)/ (細(xì)胞對照組A450 nm-空白A450 nm)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡 NR8383細(xì)胞以1×106接種于6 孔板,培養(yǎng)箱中孵育過夜后,按 “1.2.1”進(jìn)行分組及給藥處理細(xì)胞12 h。將細(xì)胞懸液收集到離心管中,1 000 r/min離心3 min,棄上清,加入預(yù)冷的PBS 重懸,用300 目濾網(wǎng)過濾后再次離心,棄上清,加入1×Annexin V binding buffer 調(diào)整細(xì)胞量,加入 Annexin V FITC、PI Solution 各 5 μl 混 勻,37 ℃ 避 光15 min,流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α和IL-6檢測 收集各組細(xì)胞后以1 000 r/min離心10 min,取細(xì)胞上清液。然后按照按試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟,酶標(biāo)儀檢測樣品450 nm 波長吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品吸光度值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得上清液中TNF-α和IL-6水平,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞中蛋白檢測 采用Western blotting法進(jìn)行檢測。提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì),BCA 法檢測蛋白質(zhì)濃度并調(diào)整蛋白濃度,然后取相同總量的蛋白,上樣到10%的SDS-PAGE 中,電泳,轉(zhuǎn)膜。待轉(zhuǎn)膜完畢后,加入5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗,4 ℃搖床孵育過夜,TBST 室溫下?lián)u床洗膜3次后加入二抗,室溫孵育30 min,TBST 清洗3次,化學(xué)發(fā)光,顯影,定影。采用Image J軟件分析電泳條帶灰度值,以目的蛋白與β-actin灰度比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism7統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料用±s表示。各組數(shù)據(jù)間比較用One-way ANOVA 法, 兩兩比較采用least significant difference(LSD)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞活性的影響 用1 mg/L LPS處理NR8383細(xì)胞12 h,可見LPS組細(xì)胞活力下降,細(xì)胞數(shù)量減少;單獨(dú)給予10 mg/L LL37處理細(xì)胞,未見對細(xì)胞活性有明顯影響;在給予LPS 刺激同時(shí)用LL37 干預(yù),LL37可明顯減弱LPS對細(xì)胞的毒性作用;同時(shí),LL37中和抗體可部分抑制LL37的作用。見圖1。

圖1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞活性的影響

2.2 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞凋亡的影響 用LPS (1 mg/L)處理NR8383細(xì)胞12 h,發(fā)現(xiàn)LPS組細(xì)胞凋亡率增加,實(shí)驗(yàn)組凋亡率減少,LL37中和抗體可抑制LL37 的保護(hù)作用,提示LL37能減輕LPS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.3 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌水平的影響 與對照組相較,LPS組TNF-α和IL-6分泌水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組在 LL37 作用下,TNF-α和IL-6分泌水平均較LPS組有所下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均＜0.05);干預(yù)組TNF-α和IL-6 分泌水平均較實(shí)驗(yàn)組組有所上升(P＜0.05)。見表1。

2.4 抗菌肽 LL37 對 LPS 致 NR8383 細(xì)胞中P-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響LPS組細(xì)胞中P-NF-κB p65蛋白表達(dá)量高于對照組 (P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中P-NF-κB p65蛋白表達(dá)量低于LPS 組 (P＜0.05);實(shí)驗(yàn)干預(yù)組細(xì)胞中P-NF-κB p65蛋白表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05),提示LL37可降低LPS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)P-NF-κB p65蛋白的增高,并且這種作用可被其中和抗體所抑制。見圖3。

圖2 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞凋亡的影響

表1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌水平的影響 (ng/L,±s)

表1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌水平的影響 (ng/L,±s)

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α;LPS為脂多糖;與對照組比較,a P ＜0.05;與 LPS 組比較,b P ＜0.05;與 LPS+LL37 組比較,c P ＜0.05

組別 TNF-α IL-6對照組 68.01±0.676 45.41±1.385 LL37組 73.86±2.86 50.41±0.661 LPS組 776.8±1.136a 566.8±8.079a LPS+LL37組 476.5±1.234b 366.1±10.63b LPS+LL37+anti-LL37組 524.2±14.76c 480.8±9.057c

3 討論

巨噬細(xì)胞活化導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的開始和炎性介質(zhì)的釋放,是宿主防御致病微生物的關(guān)鍵過程,NR8383為大鼠源肺泡巨噬細(xì)胞,是研究炎癥反應(yīng)的常用細(xì)胞模型。LPS 作為革蘭陰性細(xì)菌壁的主要成分,是一類主要的炎癥因子,可作用于多種宿主細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[6],LPS與免疫細(xì)胞表面最主要的受體之一的CD14結(jié)合并通過LPS結(jié)合蛋白LBP形成LPS-LBP-CD14三聯(lián)復(fù)合物,作用于Toll樣受體4,從而啟動跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮致炎效應(yīng)[7]。CAP-18/LL37 是目前發(fā)現(xiàn)的人類唯一的Cathelicidins 家族成員,hCAP18含有140個(gè)氨基酸殘基,是中性粒細(xì)胞特殊顆粒 (亦稱二級顆粒)中的主要蛋白質(zhì)[8],CA P18以前體蛋白形式合成后,以非活性成分儲存于顆粒中,受到刺激后,裂解產(chǎn)生它的C-端活性肽,即為LL37[9],多項(xiàng)研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗真菌等多種生物學(xué)活性,是機(jī)體免疫防御的重要組成部分[10-12],本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)大鼠噬細(xì)胞NR8383建立炎癥細(xì)胞模型,同時(shí)以抗菌肽LL37進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步研究并揭示LL37發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制。

圖3 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細(xì)胞中P-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的LPS可誘導(dǎo)該細(xì)胞表達(dá)多種炎性因子,其中TNF-α可趨化并激活中性粒細(xì)胞,IL-6可誘導(dǎo)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的分化,放大炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[13]。Nagaoka等[14]研究表明,抗菌肽 LL-37 可抑制 LPS 與CD14結(jié)合,從而抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá),產(chǎn)生TNF-α。已有研究表明,中和TNF-α可降低肺局部與全身的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度[15],在急性肺損傷時(shí)抑制炎癥反應(yīng)能減輕肺組織細(xì)胞的凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示,LPS刺激后,可導(dǎo)致NR8383細(xì)胞活性降低,凋亡增加,并且誘導(dǎo)細(xì)胞TNF-α 和IL-6的分泌顯著增多,LL37干預(yù)后可保護(hù)LPS對細(xì)胞的損傷作用,并明顯抑制TNF-α和IL-6分泌的升高趨勢,而且在給予LL37 抗體后可以中和LL37的保護(hù)作用。由此可見,LL37 可減少LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生,具有明顯的抗炎保護(hù)作用。

研究表明,LPS與巨噬細(xì)胞膜上Toll樣受體4的識別結(jié)合,可觸發(fā)下游信號街頭蛋白My D88的募集,后者又引起一系列信號級聯(lián)反應(yīng),激活I(lǐng)κB激酶 (inhibitory kappa B kinase,IKK)或促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)[15]。IKK 使IκB 發(fā)生磷酸化并釋放P50/P65,MAPK 會磷酸化下游蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子?；罨霓D(zhuǎn)錄因子P50/P65進(jìn)入到核內(nèi)與靶基因啟動子或增強(qiáng)子區(qū)特異序列結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,產(chǎn)生如TNF-α和IL-6等促炎因子[16]。本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)LL37可抑制LPS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)活化的NF-κB蛋白的表達(dá),提示LL37對細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過抑制NF-κB 信號通路,進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞分泌、活化TNF-α與IL-6發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述,抗菌肽LL37可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞炎癥,明顯抑制巨噬細(xì)胞促炎癥因子的分泌,發(fā)揮良好的抗炎作用。其抗炎機(jī)制可能與通過中和LPS,抑制巨噬細(xì)胞炎癥通路中PNF-κB p65 蛋白的表達(dá),以減少 TNF-α、IL-6 等相關(guān)促炎癥因子分泌有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突