吳丹，王靜，黃碧云，王艷，劉龍*

(1.廣州醫(yī)科大學藥學院， 廣東 廣州 511436;2.天津佰肽特醫(yī)藥科技有限公司， 天津 300000;3.信陽師范學院生命科學學院，河南 信陽 464000)

小花鬼針草(BidensparvifloraWilld. ) 為菊科(Compositae)鬼針草屬 (BidensL.)植物，全草入藥，具有清熱、解毒、抗氧化、抗瘧疾等功效[1-2]。目前，文獻報道從鬼針草屬植物中分離的化學成分主要有黃酮類、酚酸類、多炔類、揮發(fā)油等[3-4]，其中黃酮類具有有活血化淤 、降壓通脈的功效，對動脈粥樣硬化、血管栓塞疾病有預防和治療作用[5-6]；酚酸類成分具有止血、抗菌等功效[7]。

目前文獻報道的對小花鬼針草中黃酮類成分的含量檢測多采用紫外分光光度法[8]、高效液相色譜法[7, 9-10]、高效毛細管電泳法[11]等方法，這些方法雖能夠?qū)崿F(xiàn)對成分的含量測定，但存在有一定的缺陷，比如分析時間較長、方法靈敏度較低等。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)是近幾年來新興的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，與常規(guī)液相色譜相比分析速度更快、分離度及靈敏度更高，已廣泛應用于血藥濃度檢測，以及中草藥、中成藥、化學藥物有效成分與雜質(zhì)的檢測[12-15]。本文參照相關(guān)文獻中小花鬼針草黃酮類成分的檢測方法，建立了UPLC-MS/MS同時檢測小花鬼針草中6種單體成分原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、和山奈酚的方法，該方法分析時間短、靈敏度高、專屬性強，能夠為小花鬼針草的質(zhì)量控制提供有效的參考依據(jù)。

1 實驗設備與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Agilent 1290/6460，配有ESI源，Mass Hunter 工作站)；移液器(德國Eppendorf Research Plus系列)；電子分析天平(瑞士Metter Toledo ME155DU)；超純水器(美國Thermo Fisher GenPure Pro Standard)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司KQ-118)。

對照品原兒茶酸(批號110809-201205)、蘆丁(批號100080-201610)、槲皮苷(批號111538-200302)、槲皮素(批號100081-200907)、山奈酚(批號110861-201611)、芍藥苷(批號110736-201640，作為內(nèi)標物)均購自中國食品藥品檢定研究院；金絲桃苷(批號G1411047)購自阿拉丁試劑有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于等于98%。藥材小花鬼針草于2017年采自廣州新造鎮(zhèn)，由本校生藥學教研室鑒定為小花鬼針草的干燥全草。乙腈、甲醇均為色譜純；甲酸為質(zhì)譜級；水為超純水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent SB C18色譜柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序為：0～4 min，30%乙腈；4～5 min，30～80%乙腈；5～10 min，80%乙腈。流速為0.4 mL/min；進樣量1 μL，柱溫為35 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：多反應檢測(MRM)模式，負離子檢測；其他質(zhì)譜條件：源噴射電壓4000 V，離子源溫度300 ℃，干燥氣流量11.0 L/min，霧化器壓力103.4 kPa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 小花鬼針草中6種單體成分及內(nèi)標物的主要質(zhì)譜參數(shù)

2.3 混合對照品溶液的制備

2.3.1 混合對照品儲備液的配制

分別精密稱取原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素和山奈酚對照品至容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成對照品儲備液。精密移取各對照品儲備液至10 mL量瓶中，用甲醇定容得混合對照品儲備液，各標準品的質(zhì)量濃度分別為原兒茶酸25.13 μg/mL、蘆丁29.89 μg/mL、金絲桃苷27.50 μg/mL、槲皮苷13.06 μg/mL、槲皮素12.75 μg/mL和山奈酚24.25 μg/mL。

2.3.2 內(nèi)標儲備液的配制

精密稱取芍藥苷對照品至容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為210 μg/mL的內(nèi)標儲備液。

2.3.3 混合對照品溶液的配制

分別精密量取內(nèi)標儲備液10 μL，混合對照品儲備液適量，移至1.5 mL離心管中，用甲醇稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.4 樣品溶液的制備

精密稱取小花鬼針草藥材粉末(過 3 號篩)1 g，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇溶液10 mL，密塞，稱重。室溫下超聲提取60 min。提取后放至室溫，稱定質(zhì)量，用溶劑補足所失重量。取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后取濾液500 μL移至1.5 mL離心管中，加甲醇490 μL，內(nèi)標儲備液10 μL，混合均勻即得樣品溶液。

3 實驗結(jié)果

3.1 專屬性考察

分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液(不含小花鬼針草藥材)進樣分析，進樣量為1 μL，按2.1項下色譜條件及2.2項下質(zhì)譜條件分析，得原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚的混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品總離子流圖，見圖1。由圖可知方法專屬性良好，各檢測成分間無相互干擾，且空白溶液(即陰性樣品溶液)對各檢測成分無影響。

1 原兒茶酸；2 蘆??；3 金絲桃苷；4 槲皮苷；5 槲皮素；6 山奈酚；7 芍藥苷圖1 混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 EIC of mixed reference solution, test solution and negative sample solution

3.2 線性關(guān)系及定量限、檢測限考察

在2.1項色譜條件和2.2項質(zhì)譜條件下進樣檢測不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，以各待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，待測物峰面積與內(nèi)標物(芍藥苷)峰面積之比為縱坐標(Y)，繪制線性標準曲線，得到各待測成分的線性回歸方程。選取信噪比(S/N)大于10時各待測物質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ)，S/N大于3時各待測物質(zhì)量濃度作為檢測限(LOD)，結(jié)果見表2。

表2 6種單體成分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢測限

3.3 精密度實驗

取2.3項下的混合對照品溶液，連續(xù)重復進樣6次，計算各成分與內(nèi)標物的峰面積比值，并計算相對標準偏差。原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚峰面積的相對標準偏差分別為2.04%、1.95%、1.50%、1.97%、2.04%、2.15%。

3.4 穩(wěn)定性實驗

取樣品溶液，配制后在室溫下放置，分別在0、4、8、12、18 、24 h時進樣檢測，計算各待測物與內(nèi)標物的峰面積比值，并計算相對標準偏差。其相對標準偏差分別為原兒茶酸1.91%、蘆丁2.03%、金絲桃苷1.46%、槲皮苷 2.04%、、槲皮素2.13%、山奈酚2.51%。結(jié)果表明，樣品溶液在室溫條件下，24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復性實驗

取小花鬼針草粉末1 g，精密稱定，照2.4項下方法制備樣品溶液，平行制備6份，進樣檢測，并計算實測濃度。6份平行樣品各待測物實測濃度相對標準偏差分別為原兒茶酸1.35%、蘆丁1.65%、金絲桃苷 1.46%、槲皮素 4.49%、槲皮苷4.44%、山奈酚4.97%。

3.6 加樣回收率實驗

取小花鬼針草粉末1 g，精密稱定，平行稱6份。精密稱取原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚對照品適量，用甲醇溶解并定容，配制成各成分濃度分別為原兒茶酸115.6 μg/mL、蘆丁130.7 μg/mL、金絲桃苷80.2 μg/mL、槲皮苷45.2 μg/mL、槲皮素34.8 μg/mL、山奈酚10.2 μg/mL的對照品混合溶液。每份樣品中1.00 mL上述對照品混合溶液，揮干溶劑，按2.4項下方法制備樣品溶液，按2.1與2.2項下的條件進樣檢測，計算各成分的含量及回收率。結(jié)果見表3。

表3 6種待測成分的回收率實驗

續(xù)表3

3.7 樣品測定

對樣品溶液進行含量測定，得到小花鬼針草中原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚質(zhì)量分數(shù)依次為105.52 μg/g(RSD=1.35%，n=6)、120.05 μg/g(RSD=1.65%，n=6)、70.02 μg/g(RSD=1.46%，n=6)、44.88 μg/g(RSD=4.49%，n=6)、29.94 μg/g(RSD=4.44%，n=6)、9.33 μg/g(RSD=4.97%，n=6)。

3.8 討論

3.8.1 色譜條件優(yōu)化

在進行6種待測成分檢測時，為避免出現(xiàn)峰拖尾的現(xiàn)象，同時為了提高電離效率，在水相中加入少量甲酸，即選擇0.1%甲酸水作為水相。6種待測成分中蘆丁和金絲桃苷保留時間接近，色譜完全分離較困難。本文嘗試采用不同的色譜柱(Agilent SB-C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm；Agilent Eclipse C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm)，不同的流動相組合(乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水)及不同的流動相比例來實現(xiàn)兩者的完全色譜分離。結(jié)果表明，采用Agilent Eclipse C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm色譜柱及甲醇體系，兩者分離效果差，所以最終選擇Agilent SB-C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，靈敏度高，分析時間短，各待測物分離效果好，方法專屬性強。

3.8.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本文嘗試采用SIM模式對待測成分進行定量檢測，該模式下方法專屬性差，樣品溶液中干擾較多。6種待測成分及內(nèi)標物在MS2Scan及Product Ion兩種掃描模式下，均可獲取母離子及子離子信息，且Negative模式下靈敏度明顯優(yōu)于Positive模式，所以本文采用負離子MRM模式檢測6種待測成分，同時采用optimizer工作站對6種待測成分及內(nèi)標物的Fragmentor碎裂電壓、CE碰撞能進行優(yōu)化，以確保各待測成分的高響應值和高靈敏度。

3.8.3 內(nèi)標物的選擇

進行6種待測成分含量檢測時，為避免儀器進樣誤差等，本文采取內(nèi)標法。內(nèi)標物的選擇至關(guān)重要，其結(jié)構(gòu)應與待測成分類似，保留時間相近，且不得存在于小花鬼針草提取物中。本文通過對甘草酸銨、芍藥苷、異鼠李素等化合物進行分析，綜合其保留時間，最終選擇芍藥苷作為內(nèi)標物。

4 結(jié)論

本研究建立的UPLC-MS/MS分析方法，可快速分離檢測小花鬼針草中原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚的含量。該方法簡單快捷、靈敏度高，可為小花鬼針草藥材的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。