白玉琢,徐 菁,陳 潔,張佳怡,許 玥,魯 曼,李欣怡,霍則軍,張 莉△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029；2.北京大學(xué)第三醫(yī)院,北京 100191)

腰痛作為針灸和骨傷科門診常見的疾病之一，在成年人群中的發(fā)病率為60%，且病情容易反復(fù)，對(duì)患者的正常工作生活產(chǎn)生了一定的困擾[1]。多裂肌損傷關(guān)系到脊柱的核心穩(wěn)定性，在腰痛的發(fā)病過程中扮演重要角色。當(dāng)腰多裂肌受到外力挫傷、機(jī)械牽拉或化學(xué)刺激等異常因素的刺激時(shí)會(huì)引起局部組織的炎癥反應(yīng)，同時(shí)伴有傷害性刺激信號(hào)的向上傳遞。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在組織損傷的過程中，中樞小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。機(jī)體損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞的免疫細(xì)胞，被炎性細(xì)胞因子激活后對(duì)傷害性刺激做出免疫應(yīng)答，以減輕組織損傷[2-12]。臨床中針灸治療腰痛的應(yīng)用廣泛，其療效也經(jīng)過循證醫(yī)學(xué)研究的證實(shí)。本研究以電針“委中”為干預(yù)方式，擬觀察電針“委中”對(duì)腰多裂肌損傷大鼠模型多裂肌局部的炎癥指標(biāo)、脊髓和海馬MI型小膠質(zhì)細(xì)胞激活后的典型標(biāo)志物iNOS含量的變化，旨在探討電針“委中”對(duì)多裂肌損傷后脊髓和海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，為電針治療多裂肌損傷所致的腰痛提供部分依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量為(280±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可：SCXK(京)2016-0006]。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸機(jī)理實(shí)驗(yàn)室，以普通大鼠飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度(20±1)℃，濕度50%。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取空白組8只，剩余大鼠全部參與造模。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用符合科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 造模方法

本實(shí)驗(yàn)采用布比卡因鹽酸鹽(Sigma公司)多裂肌注射法制備腰多裂肌損傷型腰痛大鼠模型[13]。剩余大鼠稱重后按10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，操作過程保持無(wú)菌。確定大鼠L4、L5棘突后使用4號(hào)一次性注射器抽取0.5%布比卡因溶液在L4～L5棘突水平的雙側(cè)多裂肌處注射100 μL。進(jìn)針過程中保持針頭緊貼棘突骨面進(jìn)入多裂肌，當(dāng)針頭接觸到關(guān)節(jié)突和乳突所在骨面回抽無(wú)血?jiǎng)t表明針頭已到達(dá)腰多裂肌注射點(diǎn)，注射時(shí)間應(yīng)≥3 s，以利于藥物的吸收。完成整個(gè)造模過程共注射4個(gè)點(diǎn)(L4、L5棘突水平左右各1點(diǎn))，每點(diǎn)注射100 μL。見圖1。

圖1 L4～L5水平多裂肌注射點(diǎn)(雙側(cè))

1.3 分組及干預(yù)方式

空白組(n=8)：不做任何處理，只做觀察，與其它組大鼠同步取材。

模型組(n=16)：造模后隨機(jī)抽取模型1天組8只和模型3天組8只，觀察完成后同步取材。

電針組(n=16)：隨機(jī)抽取電針1天組8只和電針3天組8只。將大鼠固定在特制的固定器上，暴露后肢。選取“委中”穴，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(李忠仁，新世紀(jì)全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材，中國(guó)中醫(yī)藥出版社)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，選取雙側(cè)“委中穴”(膝關(guān)節(jié)背面正中)。用華佗牌0.30 mm×13 mm一次性針灸針，針刺后連接韓式電針儀(HANS-100B)，2/100 Hz的疏密波，電流強(qiáng)度1～2 mA，持續(xù)20 min，1次/天。每組分別在治療的第1天、3天的時(shí)間點(diǎn)同步取材各8只。

1.4 取材與檢測(cè)

各組大鼠稱重后以10%水合氯醛(350 mg/kg)行腹腔注射麻醉后取材。剔除大鼠背部皮毛、淺筋膜，充分暴露腰部肌肉，剝離豎脊肌和髂肋肌，銳性切除L4和L5節(jié)段多裂肌組織，取多裂肌置于4%多聚甲醛溶液中固定氮保存。冰盤上取腰椎脊髓，暴露腰椎，骨咬剪斷下端腰椎，以剪刀延椎板兩邊剪開腰段脊髓，液氮保存，待測(cè)。斷頭取腦，冰袋上迅速分離出大鼠海馬，置于液氮中保存待檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

將備好的多裂肌組織、脊髓組織、海馬組織高速離心后的組織上清液按照1∶30倍的洗滌液用去離子水稀釋后攪拌均勻低溫保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)多裂肌組織中的IL-6、TNF-α、iNOS，脊髓和海馬組織中的iNOS含量。

從試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，按照6 000～10 000 rpm高速離心30 s。取5個(gè)1.5 mL離心管(S5～S1)依次排列，各加入150 μL樣本稀釋液，吸取150 μL標(biāo)準(zhǔn)品到第1個(gè)離心管中(S5)，輕輕混勻，從S5中吸取150 μL到第2個(gè)離心管(S4)，輕輕混勻，依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋。將各種試劑移至室溫(18～25℃)下平衡靜置30 min后按前述方法配制試劑，備用。分別設(shè)空白孔(空白孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余步驟相同)、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37℃溫育30 min后棄去液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，250 μL/孔，甩干。每孔加酶標(biāo)試劑50 μL，覆上新的板貼，37℃溫育30 min后棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。每孔依序加入底物溶液A 50 μL、底物溶液B 50 μL，37℃避光顯色10 min。依序在每孔中加入終止液50 μL，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠多裂肌組織IL-6、TNF-α、iNOS含量比較

與空白組比較，模型1天組多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量顯著升高(P<0.01),模型3天組多裂肌IL-6、iNOS的含量升高(P<0.05),TNF-α的含量顯著升高(P<0.01);與模型1天組比較，模型3天組多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量降低(P<0.05),電針1天組多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS的含量顯著降低(P<0.01)；與模型3天組比較，電針3天組多裂肌IL-6、iNOS含量雖有降低但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，TNF-α含量顯著降低(P<0.01)；與電針1天組比較，電針3天組多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量雖有降低但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1、圖2。

表1 各組大鼠多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量比較

注：與空白組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型1 d組比較，■P<0.05,■■P<0.01;與模型3 d組比較，△P<0.01。

注：與空白組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型1 d組比較，■P<0.05,■■P<0.01;與模型3 d組比較，△P<0.01。圖2 各組大鼠多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量比較

2.2 各組大鼠脊髓和海馬組織iNOS含量比較

與空白組比較，模型1天組和模型3天組脊髓和海馬的iNOS含量升高(P<0.05或P<0.01)；與模型1天組比較，模型3天組和電針1天組脊髓和海馬的iNOS含量降低(P<0.05或P<0.01)；與模型3天組比較，電針3天組脊髓和海馬的iNOS含量雖有降低但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與電針1天組比較，電針3天組脊髓和海馬的iNOS含量雖有降低但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖3。

2.3 大鼠多裂肌、脊髓、海馬組織iNOS含量的比較

總體來(lái)看，模型1天組多裂肌iNOS含量>脊髓>海馬，模型3天組脊髓和多裂肌iNOS含量>海馬，電針1天組和電針3天組脊髓iNOS含量>多裂肌>海馬,電針1天組海馬iNOS含量降低最顯著。見圖4。

表2 各組大鼠脊髓和海馬iNOS含量比較

注： 與空白組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型1 d組比較，■P<0.05,■■P<0.01。

注： 與空白組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型1 d組比較，■P<0.05,■■P<0.01。圖3 各組大鼠脊髓和海馬iNOS含量的比較

圖4 各組大鼠多裂肌、脊髓、海馬iNOS含量比較

3 討論

多裂肌損傷和腰痛的發(fā)生關(guān)系密切。既往研究[14]表明，小膠質(zhì)細(xì)胞在組織損傷信號(hào)的傳遞和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是廣泛分布于脊髓、大腦皮質(zhì)、海馬組織中神經(jīng)免疫細(xì)胞。組織損傷后，受損的感覺神經(jīng)元釋放的CCL2、CX3CL1、NRG1、MMP-9及CSF1等趨化因子與脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合后促使小膠質(zhì)細(xì)胞向受損部位聚集[13,15-18]。

團(tuán)隊(duì)前期研究[19-22]發(fā)現(xiàn)，布比卡因注射后可引起大鼠腰多裂肌纖維的大面積壞死，注射24 h后即可出現(xiàn)局部多裂肌肌纖維的大量變性壞死和肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，組織局部炎癥明顯，巨噬細(xì)胞分泌大量的炎癥細(xì)胞因子。IL-6、TNF-α、iNOS是典型的炎性因子，損傷早期由巨噬細(xì)胞分泌，有學(xué)者[23-24]在脊髓損傷模型早期觀察到TNF-α、IL-1β等炎性因子的含量升高，高濃度的炎性因子刺激局部傷害性刺激感受器后使感覺神經(jīng)元敏化進(jìn)而激活脊髓和海馬M1型小膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞M1型具有強(qiáng)烈的吞噬功能，在吞噬壞死細(xì)胞器的過程中也分泌iNOS和活性氧等促炎因子，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷。iNOS作為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的表面特殊標(biāo)記物，其含量反應(yīng)了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)[25]。

針灸是非藥物療法中治療腰痛的理想方式，委中穴屬于膀胱經(jīng)的合穴，是臨床治療腰痛首選的遠(yuǎn)端穴[26]。在基礎(chǔ)研究方面，電針對(duì)多裂肌損傷的治療作用已有研究證實(shí)，電針“委中”可通過調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化,促進(jìn)多裂肌損傷后的再生修復(fù)[27]。電針調(diào)控脊髓和海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的激活也是治療AD、PD以及髓核型腰痛等疾病的重要機(jī)制。有研究[28-29]發(fā)現(xiàn)，電針可通過調(diào)控海馬組織中的炎性因子IL-1β和TNF-α相關(guān)基因的表達(dá)抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活,保護(hù)AD大鼠的神經(jīng)元。電針可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型的過度激活,減輕脊髓后角的炎癥損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型1天組多裂肌炎性因子IL-6、TNF-α、iNOS含量顯著高于空白組，脊髓和海馬iNOS含量顯著高于空白組，表明在多裂肌急性損傷期，多裂肌、脊髓、海馬均表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)；模型3天組多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量低于模型1天組，脊髓和海馬的iNOS含量低于模型1天組，表明造模3天后多裂肌、脊髓和海馬的炎癥反應(yīng)開始減弱，這可能是因?yàn)樵炷?天后損傷組織開始修復(fù)；電針1天組多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量，脊髓和海馬的iNOS含量均顯著低于模型1天組；電針3天組多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量，脊髓和海馬的iNOS含量和模型3天組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明，電針“委中”治療1天后可顯著降低多裂肌、脊髓和海馬的炎性因子含量。而比較多裂肌、脊髓、海馬的iNOS含量，可以發(fā)現(xiàn)，模型1天組多裂肌iNOS含量>脊髓>海馬，模型3天組脊髓和多裂肌iNOS含量>海馬，電針1天組和電針3天組脊髓iNOS含量>多裂肌>海馬，而電針1天組海馬iNOS含量降低最顯著。這表明電針“委中”可有效降低腰多裂肌損傷模型大鼠多裂肌局部和中樞炎性因子IL-6、TNF-α、iNOS的含量，在一定程度上抑制脊髓和海馬M1小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，這種效應(yīng)主要體現(xiàn)在損傷急性期，然而關(guān)于電針“委中”通過何種途徑抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的激活則需要在今后的研究中完善。