王旺 李遠(yuǎn)鋒 林影 梁書利

摘 要：為了確定植酸酶發(fā)酵過(guò)程中最合適的甲醇流加速率，對(duì)畢赤酵母工程菌15L罐發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的工藝條件進(jìn)行了研究，通過(guò)控制3種甲醇流加速率，探討不同甲醇流加速率條件下的畢赤酵母工程菌的植酸酶產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：畢赤酵母;植酸酶;甲醇流加速率;發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ922 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）09-0254-03

植酸酶（EC 3.1.3.8或EC 3.1.3.26）是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（磷酸鹽）的酶類總稱，一方面它可以有效提高動(dòng)物對(duì)磷的吸收利用率，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;另一方面可減少動(dòng)物糞便中磷排泄量，從而減少環(huán)境的磷污染[1]。目前，養(yǎng)殖業(yè)對(duì)植酸酶的需求越來(lái)越大，2010年國(guó)際植酸酶峰會(huì)報(bào)道，全球植酸酶市場(chǎng)占飼料酶市場(chǎng)60% 以上，產(chǎn)值3.5億美元/年，家禽和豬飼料大約70%都添加植酸酶[2]。與此同時(shí)，植酸酶的生產(chǎn)成本也日益受到關(guān)注[3]。因此，提高植酸酶產(chǎn)量并降低其生產(chǎn)成本成為當(dāng)前植酸酶研究和生產(chǎn)的重要課題。

畢赤酵母產(chǎn)植酸酶發(fā)酵工藝的優(yōu)化已有許多相關(guān)報(bào)道。趙凱等[3，4]考察了不同比生長(zhǎng)速率和誘導(dǎo)濕重對(duì)重組畢赤酵母基因工程菌Mut+發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的影響。閔兆升等[5]采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)畢赤酵母工程菌H311產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。黃魁英等[6]對(duì)耐高溫植酸酶畢赤酵母工程菌PEY-2中試發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。

甲醇流加對(duì)微生物發(fā)酵影響的研究也有報(bào)道。李清亮等[7]考察了5L發(fā)酵罐中三種甲醇流加策略（恒溶氧、恒比生長(zhǎng)速率和恒甲醇濃度）對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)人肝再生增強(qiáng)因子（hALR）的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明控制恒定甲醇濃度進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，甲醇比消耗速率和hALR表達(dá)速率顯著高于其它兩種流加策略。陳多等[8]依據(jù)已有畢赤酵母發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，設(shè)定最優(yōu)化問(wèn)題，利用迭代循環(huán)確定最優(yōu)乘子并求解最優(yōu)甲醇流加軌跡，實(shí)驗(yàn)證明優(yōu)化后的甲醇流加方法可以使畢赤酵母表達(dá)的鼠李糖苷酶產(chǎn)量提高15%。王水蓮等[9]考察了不同甲醇流加濃度對(duì)重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸（SAMe）的影響，在發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵液中甲醇濃度并測(cè)定外源蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)補(bǔ)加甲醇的量為0.5%時(shí)腺苷蛋氨酸表達(dá)量最高。

畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的過(guò)程中，甲醇作為發(fā)酵過(guò)程中的碳源和誘導(dǎo)劑，其流加策略、流加速率及誘導(dǎo)方式都直接影響菌體的生長(zhǎng)與外源蛋白的表達(dá)。當(dāng)甲醇流加速率過(guò)低時(shí)，甲醇濃度不足，菌體的生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)都將受到抑制，而甲醇流加速率過(guò)高則會(huì)造成菌體中毒，抑制菌體生長(zhǎng)時(shí)[10]。目前，通過(guò)甲醇流加速率控制甲醇濃度對(duì)畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶方面的研究未見報(bào)道。本文研究了3.5g/（L·h）、5.5g/（L·h）、7.5g/（L·h）這3種甲醇流加速率下，畢赤酵母工程菌GAP-P180-AOX-HAC1-YNP01（簡(jiǎn)寫為GAY1）的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶變化，確定了最適合畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵積累植酸酶的甲醇流加速率。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）菌株。菌株為前期工作所構(gòu)建的基因工程菌株GAY1（基于畢赤酵母，通過(guò)基因改造手段獲得），華南理工大學(xué)酶學(xué)與酶工程實(shí)驗(yàn)室保種。（2）試劑。酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無(wú)氨基酵母氮源YNB（含硫酸銨）、生物素、丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨、甲醇、甘油、釩酸銨、鉬酸銨、硝酸、乙酸、乙酸鈉、植酸鈉。（3）培養(yǎng)基和終止顯色液。YPD種子培養(yǎng)基（1L）：10g酵母粉，20g蛋白胨，10g葡萄糖。

BSM發(fā)酵培養(yǎng)基：1.49%（W/V）七水硫酸鎂，0.094%（W/V）硫酸鈣，1.82%（W/V）硫酸鉀，2.67%（V/V）磷酸，0.413%（W/V）氫氧化鉀，4%（W/V）甘油，121℃蒸汽滅菌30min，冷卻至30℃，添加0.435%（V/V）PTM1。

PTM1微量元素溶液：0.08g碘化鈉，6.00g五水硫酸銅，0.02g硼酸，20.00g氯化鋅，3.00g一水硫酸錳，0.20g二水鉬酸鈉，0.50g氯化鈷，0.20g生物素，65.00g七水硫酸亞鐵，1mL濃硫酸，用去離子水定容至1L，再用0.22μm孔徑無(wú)菌水相濾膜過(guò)濾，4℃保藏備用。

硝酸溶液：濃硝酸與水按體積比1：2混合均勻。

終止顯色液：硝酸、100g/L鉬酸銨、2.35g/L釩酸銨按體積比2：1：1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

（1）種子培養(yǎng)。將保藏菌種接種到Y(jié)PD平板上劃線，30℃培養(yǎng)24h，從平板培養(yǎng)基上挑取酵母單克隆接種于10mL YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃，250r/min條件下培養(yǎng)18-24h，再按照10%接種量接種YPD培養(yǎng)基擴(kuò)培18-24h，然后按照8%接種量接入發(fā)酵罐BSM培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。（2）發(fā)酵控制。甘油生長(zhǎng)階段流加氨水控制pH5.5，溫度設(shè)定為30℃。甘油耗盡后通過(guò)流加含12mL/L微量鹽（PTM1）培養(yǎng)基的50%的甘油增加菌濃，控制相同菌體OD600（200左右）開始誘導(dǎo)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和測(cè)量的菌濃控制不同的甲醇流加速率3.5g/（L·h）、5.5g/（L·h）、7.5g/（L·h）進(jìn)行相應(yīng)的甲醇補(bǔ)料誘導(dǎo)植酸酶表達(dá)。此時(shí)，流加氨水控制pH6.0，溫度設(shè)定為25℃。每隔8h取樣測(cè)測(cè)量。（3）分析方法。生長(zhǎng)檢測(cè)。用OD600表示菌體生長(zhǎng)，取發(fā)酵液利用UV2350型紫外分光光度儀，在波長(zhǎng)600nm處檢測(cè)吸光值。

酶活測(cè)定。酶活測(cè)定采用鉬釩酸銨法[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲醇流加速率為3.5g/（L·h）時(shí)的發(fā)酵情況

發(fā)酵液底料中含有4%的甘油，甘油耗盡之后DO回升，此時(shí)開始流加50%的甘油直至誘導(dǎo)所需OD600為250（大約發(fā)酵時(shí)間30h），之后停止流加甘油，饑餓60min左右，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶。初始甲醇流加速度為1g/（L·h），每?jī)尚r(shí)提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度為3.5g/（L·h）時(shí)，停止繼續(xù)提高，并以該流速流加至發(fā)酵結(jié)束。該流加速度下的發(fā)酵情況如圖1。

由圖1可知，發(fā)酵到40h，菌體OD600達(dá)到259，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，隨后菌體OD600和酶活隨發(fā)酵時(shí)間增加而增加，發(fā)酵至176h下罐時(shí)，菌體OD600達(dá)到460，植酸酶酶活達(dá)到24698U/mL。

2.2 甲醇流加速率為5.5g/（L·h）時(shí)的發(fā)酵情況

甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前的過(guò)程同2.1。初始甲醇流加速度為1g/（L·h），每?jī)尚r(shí)提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度為5.5g/（L·h）時(shí)，停止繼續(xù)提高，并以該流速流加至發(fā)酵結(jié)束。該流加速度下的發(fā)酵情況如圖2。

由圖2可知，發(fā)酵到40h，菌體OD600達(dá)到252，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，隨后菌體OD600和酶活隨發(fā)酵時(shí)間增加而增加，發(fā)酵至144h菌體OD600達(dá)到最大579，發(fā)酵至168h酶活達(dá)到最大26386U/mL，相較于甲醇流加速率3.5g/（L·h）酶活提高了6.83%，OD600提高了25.87%。發(fā)酵至176h下罐時(shí)，菌體OD600為511，酶活25864U/mL。

2.3 甲醇流加速率為7.5g/（L·h）時(shí)的發(fā)酵情況

甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前的過(guò)程同2.1。初始甲醇流加速度為1g/（L·h），每?jī)尚r(shí)提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度為7.5g/（L·h）時(shí)，停止繼續(xù)提高，并以該流速流加至發(fā)酵結(jié)束。該流加速度下的發(fā)酵情況如圖3。

由圖3可知，發(fā)酵到40h，菌體OD600達(dá)到238，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，隨后菌體OD600和酶活隨發(fā)酵時(shí)間增加而增加，發(fā)酵至152h菌體OD600達(dá)到最大578，發(fā)酵至160h酶活達(dá)到最大22108U/mL，相較于甲醇流加速率3.5g/（L·h）OD600提高了25.65%但酶活降低了10.49%，而相較于甲醇流加速率5.5g/（L·h）OD600相近，但酶活降低了16.21%。發(fā)酵至176h下罐時(shí)，菌體OD600為518，酶活21863U/mL。

綜合以上分析，可以推斷出甲醇流加速率3.5g/（L·h）條件下，甲醇流加量不足，菌體的生長(zhǎng)和酶活都受到限制。甲醇流加速率7.5g/（L·h）條件下，雖然菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)充足，菌體生長(zhǎng)不再受限，但甲醇積累量偏高，抑制了植酸酶酶活。甲醇流加速率5.5g/（L·h）條件下菌體生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，植酸酶酶活也未受到影響，因此，甲醇流加速率5.5g/（L·h）最適合畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶。

3 結(jié)語(yǔ)

該試驗(yàn)通過(guò)控制溫度、pH等，改變誘導(dǎo)階段甲醇流加速率的發(fā)酵條件，探討了畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶規(guī)律，發(fā)現(xiàn)5.5g/（L·h）甲醇流加速率條件下，菌體在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和植酸酶酶活都處于更理想的狀態(tài)，得出結(jié)論：甲醇流加速率5.5g/（L·h）最適合于畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶。該試驗(yàn)確定畢赤酵母工程菌發(fā)酵過(guò)程中甲醇流加速率的控制策略，建立了基因工程菌株產(chǎn)植酸酶能力的評(píng)價(jià)體系，對(duì)植酸酶的實(shí)際工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)具有參考價(jià)值。

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