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        納米硒對肉雞六價鉻中毒的影響

        2019-06-25 01:44:31趙雅麗周東海
        湖北畜牧獸醫(yī) 2019年5期
        關鍵詞:肉雞

        趙雅麗 周東海

        摘要:目前肉雞鉻中毒沒有具體明確的治療方案,納米硒在減輕重金屬中毒方面作用突出。為研究納米硒補充劑對鉻(VI)(K2Cr2O7)中毒肉雞的影響,通過高通量測序選取兩個改變比較大的基因ACACA和CPT1A.,以此來探索納米硒是否對肉雞鉻中毒具有預防和治療作用。試驗將180只一日齡肉雞分成6組:空白對照組、鉻中毒組、納米硒保護組、納米硒治療組、納米硒預防組、納米硒對照組,每組3次重復。喂養(yǎng)35 d后,取出肝臟,HE染色,RT-qPCR進行驗證。結果表明:①鉻中毒組肉雞的肝臟切片可見細胞破裂,輪廓不清晰,細胞核破裂,核固縮,肝竇間隙增大,中央靜脈管擴張;其他組的一部分肝臟細胞處于正常狀態(tài),一小部分被破壞。②用納米硒治療之后,ACACA基因上調幅度降低,CPT1A基因下調幅度降低,說明納米硒可以減輕鉻對肉雞的影響。該結論為以后研究鉻中毒和治療鉻中毒提供了一個重要思路和方向。

        關鍵詞:鉻中毒;納米硒;肉雞;ACACA基因;CPT1A基因

        中圖分類號:S859.8? ? ? ? 文獻標識碼:A? ? ? ? 文章編號:1007-273X(2019)05-0010-02

        鉻是一種微量元素,常見的價態(tài)為+2、+3、+6,三價鉻是對人體有益的微量元素,六價鉻的毒性較強.一般認為六價鉻毒性是三價鉻的1 000倍,Cr(VI) 還具有強氧化性和腐蝕性,因此,鉻的毒性研究主要集中在Cr(VI)化合物上[1].目前為止,人們在鉻中毒上的研究都是在大鼠,小鼠上[2],肉雞鉻中毒研究幾乎空白,肉雞鉻中毒的預防和治療方法較少,所以我們對此進行了研究。已知納米硒是一種新型材料,對于預防重金屬中毒有重要作用,早期在動物的基礎日糧中添加諸如Na2SeO4、Na2SeO3等無機硒,這一補硒方式有很多明顯缺點,如轉化率低,對環(huán)境有害等,當前已經(jīng)有部分國家禁止無機硒作為補充劑來直接使用,而廣泛使用有機硒[3-6]。鉻也是一種重金屬,因此用納米硒去預防和治療肉雞鉻中毒是可行的。

        肉雞鉻中毒之后,通過高通量測序,檢測到ACACA和CPT1A這兩個基因表達量變化較大,ACACA是一個上調基因,CPT1A是一個下調基因。本試驗主要是采用納米硒治療鉻中毒肉雞,通過HE染色和RT-qPCR觀察ACACA和CPT1A基因上調下調情況,以此來驗證納米硒對肉雞鉻中毒是否有預防、治療和保護作用。

        1? 材料與方法

        1.1? 材料

        一日齡肉雞(購于宜昌正大畜牧武漢分公司);重鉻酸鉀(化學式:K2Cr2O7;分子質量:294.19;基準級,天津天灝化工廠生產(chǎn),含量99.8%以上);納米硒(含量99.99%以上,200目,平均粒徑40 nm);伊紅染色液;蘇木素染液;10%福爾馬林溶液; RNA提取、反轉錄試劑盒(武漢谷歌生物公司);初級兔單克隆抗ACACA和CPT1A抗體(武漢AB克隆技術公司)。

        1.2? 方法

        急性試驗:選取健康雛雞20只適應性喂養(yǎng)6 d后,隨機分為A、B、C、D 4組,每組5只。依照預試驗中確定的雛雞致死濃度范圍,按Horn氏法設計 K2Cr2O7劑量如下:0.100、0.464、1.000和2.150 g/kg體重。經(jīng)口灌胃染毒,灌胃容積按照各自雛雞體重的1%計算,灌胃前將試驗用雛雞禁食6 h,飲水不限,觀察14 d。根據(jù)Horn表計算得出K2Cr2O7對雛雞的半數(shù)致死量(LD50)為0.464 g/kg體重,95%可信限為2.98~7.23[7,8]。

        1.3? 造模

        180只AA一日齡雛雞,飼養(yǎng)1周之后分為6組:空白對照組(基礎日糧和清水)、鉻中毒組[0.037 g/(kg·d)的K2Cr2O7)、納米硒對照組(基礎日糧和0.5 mg/(kg·d)的納米硒]、納米硒保護組[0.037 g/(kg·d)的K2Cr2O7和0.5 mg/(kg·d)納米硒同時飼喂]、納米硒治療組[飼喂2周0.037 g/(kg·d)的K2Cr2O7之后加入0.5 mg/(kg·d)納米硒飼喂]、納米硒預防組[飼喂2周 0.5 mg/(kg·d)納米硒后再加入0.037 g/(kg·d)的K2Cr2O7飼喂]。試驗雞采用舍內籠養(yǎng),自由采食飲水。育雛時溫度控制在34 ℃左右,然后每周控制溫度下降2~3 ℃直至恒溫,直到試驗結束[9,10]。

        1.4? HE染色

        35 d之后,處死肉雞,按照試驗要求取肝臟,用生理鹽水清洗,然后迅速放入4%多聚甲醛固定液中固定,24 h后進行組織蠟塊制作。

        1.5? RT-qPCR

        根據(jù)試驗要求提取總RNA,然后電泳檢測RNA的穩(wěn)定性.之后進行反轉錄,再根據(jù)NCBI主頁GeneBank已公布的目的基因序列,應用Primer premier 5.0軟件設計引物,同時參考文獻中提及的引物序列。引物設計見表1。之后進行實時熒光定量PCR,熒光定量體系見表2。

        2? 結果與分析

        2.1? 生長特征觀察

        在整個試驗過程中,空白對照組和納米硒對照組雞的行為特征,體重以及剖檢病變無異常;鉻中毒組雞的精神不佳,體型偏小,被毛粗亂無光澤;添加納米硒組雞比鉻中毒組雞體型稍大,體重增加,精神狀態(tài)良好。試驗過程中無試驗動物死亡。

        2.2? 病理切片觀察

        肉雞肝臟組織病理切片見圖1。圖1a和圖1f為空白對照組和納米硒對照組,可見其細胞膜、細胞核清晰,肝竇隙均正常;圖1b為鉻中毒組的肝臟切片,可見其細胞破裂,輪廓不清晰,細胞核破裂,核固縮,肝竇間隙增大,中央靜脈管擴張;圖1c為納米硒保護組的肝臟切片,可見其一部分肝細胞處于正常狀態(tài),小部分被破壞;納米硒治療組(圖1d)和納米硒預防組(圖1e)肝細胞比鉻中毒組的肝細胞狀態(tài)好。

        2.3? Rt-qPCR

        圖2顯示了35 d肉雞肝細胞內ACACA基因的相對表達水平。與空白對照組比較,鉻中毒組的ACACA基團表達水平顯著升高(P<0.01)。與鉻中毒組相比,納米硒對照組、納米硒保護組、納米硒治療組及納米硒預防組的肝臟樣本中的ACACA基因相對表達水平顯著下調(P<0.05)。

        圖3顯示了35 d肉雞肝臟的CPT1A基因相對表達水平。與空白對照組相比,鉻中毒組CPT1A基因相對表達水平顯著降低(P<0.01)。與鉻中毒組相比,添加納米硒的4個組CPT1A 相對表達水平均顯著上調(P<0.05)。

        3? 討論

        通過納米硒預防和治療肉雞鉻中毒試驗可知,使用納米硒添加劑之后,肉雞的體重、毛色、肝臟病理狀態(tài)都有所好轉;ACACA和CPT1A兩個基因的表達水平比鉻中毒狀態(tài)下的改變幅度降低。由此可知,納米硒對肉雞鉻中毒有預防和保護作用,該結論可為今后研究肉雞鉻中毒的機理提供參考。

        參考文獻:

        [1] KIMURA T.Molecular mechanism involved in chromium(VI) toxicity[J].Yakugaku? zasshi,2007,127(12):1957-1965.

        [2] ZHU? Q.How is our body detoxified[J].Biological bulletin,2013, 48(7):13-19.

        [3] ANAD S S. Protective effect of vitamin B6 in chromium-induced oxidative stress in liver[J].Journal of applied toxicology,2005,25:440-443.

        [4] 王勝男.六價絡對雞肝功能和抗氧化性能的影晌[D].山東泰安:山東農業(yè)大學,2015.

        [5] 王? 洋.硒對六價鉻雞中毒肝損傷的影響研究[D].山東泰安:山東農業(yè)大學,2017.

        [6] XUETING L,REHMAN M U,MEHMOOD K,et al. Ameliorative effects of nano-elemental selenium against hexavalent chromium induced apoptosis in broiler liver[J].Environmental science and pollution research,2018,25(16):15609-15615.

        [7] 楊芝華,考慶君.三價鉻和六價鉻小鼠急性毒性及致突變性研究[J].浙江預防醫(yī)學,2011,23(1):17-21.

        [8] 李桂影.鉻中毒的臨床反應和實驗研究[J].醫(yī)學地理分冊,2002, 23(1):33-35.

        [9] HAO P,ZHU Y,WANG S et al. Selenium administration alleviates toxicity of chromium(VI) in the chicken brain[J].Biological trace element research,2017,178:127-135.

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