舒加樂 鄭琳琳

摘要：利用同源重組的原理構(gòu)建了單增李斯特氏菌NrdD基因插入突變株，從大腸桿菌基因組中分別擴(kuò)增出NrdD基因上下游同源臂，與pKSV7質(zhì)粒相連，構(gòu)建成功重組突變載體pKSV7-D1D2，將其電轉(zhuǎn)入單增李斯特菌后，用氯霉素抗性平板篩選得到NrdD基因插入突變株，并對(duì)突變菌株序列測定，證明回復(fù)突變株構(gòu)建成功。該突變株可在嚴(yán)格無氧環(huán)境中生存，為進(jìn)一步研究NrdD基因功能、單增李斯特的致病機(jī)制和疫苗載體的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：單增李斯特菌;NrdD基因;突變株;同源重組

中圖分類號(hào)：R392.11? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2019）05-0005-02

李斯特菌病是由單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）引起的一種人獸共患病，能夠引起人、羊、豬等動(dòng)物疾病。人感染后能引發(fā)腦膜炎、發(fā)熱性敗血性胃腸炎等臨床癥狀，感染后發(fā)病死亡率約為25%。單增李斯特氏菌為一種革蘭氏陽性、兼性厭氧胞內(nèi)寄生菌，但無法在嚴(yán)格的無氧條件下生長，廣泛寄生于肉類、蛋類、海產(chǎn)品、乳制品和蔬菜細(xì)胞內(nèi)，己被世界衛(wèi)生組織列為四大食源性致病菌之一[1]。因此研制預(yù)防李斯特菌病的疫苗迫在眉睫。但因其特殊的寄生定殖方式導(dǎo)致其疫苗的開發(fā)比較緩慢，構(gòu)建能在動(dòng)物腸道等無氧環(huán)境中生存的突變菌株可作為減毒細(xì)菌疫苗載體，給研制口服疫苗提供重要的基礎(chǔ)，這對(duì)動(dòng)物疫病的預(yù)防和控制有重要意義。

NrdD基因是大腸桿菌在厭氧環(huán)境中高度表達(dá)的一種基因，現(xiàn)已被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌在無氧環(huán)境中的代謝途徑[2]。有報(bào)道稱LM的標(biāo)準(zhǔn)株EGD-e基因組中無NrdD基因，因此在腸道內(nèi)的存活率不高，導(dǎo)致其滯留時(shí)間短，不能快速有效地產(chǎn)生免疫反應(yīng)[3]。

LM作為致死率極高的胞內(nèi)寄生菌，能經(jīng)受高溫烹飪、胃部強(qiáng)酸環(huán)境等逆境后隨食物到達(dá)腸道。隨后LM通過內(nèi)化作用進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞或吞噬細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間進(jìn)行增殖，再隨淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)胎盤和大腦，引起孕婦流產(chǎn)或腦膜炎、敗血癥等臨床癥狀，嚴(yán)重的可造成肝和脾的膿腫以及局部壞死。LM獨(dú)特的致病機(jī)制使其具備了作為疫苗載體的優(yōu)秀潛質(zhì)[4]。如果將單增李斯特菌做減毒處理，將其作為載體轉(zhuǎn)入腫瘤抗原等制成的腫瘤疫苗，就可以起到激發(fā)細(xì)胞免疫特異殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株與質(zhì)粒? 單增李斯特菌減毒株LM1003（以EGD-e為模板）;穿梭載體pKSV7;克隆載體pMD18-T。

1.1.2? 主要試劑? rTaq DNA聚合酶、dNTP等;基因組DNA提取試劑盒，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒，限制性內(nèi)切酶SalI，BamHI，T4 DNA連接酶;氨芐青霉素，氯霉素，卡那霉素;BHI培養(yǎng)基。

1.1.3? 引物及測序? 引物根據(jù)NCBI序列（ID：948755）設(shè)計(jì)（表1）。

1.2? 方法

1.2.1? 質(zhì)粒構(gòu)建? 將減毒株LM1003（actA/plcB雙缺失）菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h。取5 mL菌液離心后提取LM1003全基因組。取2μL基因組DNA為模板，擴(kuò)增NrdD基因上下游序列。將擴(kuò)增得到的兩個(gè)片段進(jìn)行酶切，連接后，轉(zhuǎn)入克隆載體pMD-18T中。將連接產(chǎn)物pMD-18T-D1、pMD-18T-D2轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素的LB平板生長即表示轉(zhuǎn)入成功，并用PCR驗(yàn)證。

1.2.2? 重組質(zhì)粒pKSV7-D1D2的構(gòu)建? 從驗(yàn)證后的pMD-18T-D1D2質(zhì)粒中擴(kuò)增D1D2片段，基因片段回收后，分別將D1D2片段和pKSV7穿梭載體質(zhì)粒雙酶切，連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂氨芐青霉素抗性平板，進(jìn)行PCR鑒定后送公司測序。

1.2.3? 電轉(zhuǎn)? 將重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔD1D2電轉(zhuǎn)到單增李斯特菌中，涂在含氯霉素的BHI平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至平板上長出單菌落。

1.2.4? NrdD插入突變菌株的篩選? 挑取氯霉素平板上的單菌落接種于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，做菌液PCR鑒定。將陽性菌落接種于BHI培養(yǎng)基中傳代，每12 h傳代1次。含氯霉素抗性的37 ℃?zhèn)?代，無抗性的41 ℃?zhèn)?代，將末次傳代菌液進(jìn)行平板劃線（含氯霉素）篩選1代，挑取平板上的單菌落接種于37 ℃無抗性傳5代，41 ℃無抗性傳5代，將末次傳代菌液進(jìn)行平板劃線（含氯霉素）篩選1代，以使基因發(fā)生同源重組，將末次培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行氯霉素抗性板劃線和無抗性板劃線培養(yǎng)，得到在抗性板上不生長在無抗性板上生長的單菌落，即為疑似NrdD插入突變菌株，最終通過PCR和序列測定驗(yàn)證NrdD是否插入突變成功。

1.2.5? NrdD回復(fù)菌株的鑒定-細(xì)菌RNA的抽提和RT-PCR? 將LM1003和LM1025單個(gè)菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后收集于1.5 mL離心管中。提取RNA，RT-PCR檢測NrdD基因是否成功表達(dá)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 插入突變菌株的構(gòu)建及篩選

將構(gòu)建好的pKSV7-D1D2重組載體電轉(zhuǎn)入單增李斯特菌LM1003后，將含有重組載體的菌落進(jìn)行氯霉素和溫度篩選。菌落PCR鑒定結(jié)果見圖1。

2.2? pKSV7-D1D2序列驗(yàn)證

將陽性的pKSV7-D1D2克隆重新接種含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒，取10 μL質(zhì)粒測序。圖2為在NCBI序列對(duì)比圖，圖3為峰圖。確認(rèn)pKSV7-D1D2序列正確。

3? 小結(jié)與討論

基因敲除不僅是研究基因功能的重要分子生物學(xué)手段，也是制備減毒疫苗的重要策略之一，對(duì)毒力基因的敲除可以大大加快減毒疫苗的研發(fā)速度。本研究構(gòu)建了既能在大腸艾希氏菌表達(dá)又能在單增李斯特菌表達(dá)的穿梭載體質(zhì)粒，利用生物體內(nèi)的同源重組及抗生素抗性和溫度篩選得到了單增李斯特菌的NrdD基因插入突變菌株，并且通過PCR和序列測定驗(yàn)證NrdD插入突變成功，為基因功能的研究和減毒疫苗的研發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李云霞，陳雯雯，顧晨榮，等.單增李斯特菌的檢測方法研究進(jìn)展[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015（6）：687-693.

[2] SUN X，HARDER J，KROOK M，et al.A possible glycine radical in anaerobic ribonucleotide reductase from Escherichia coli：nucleotide sequence of the cloned nrdD gene[J].National academy of sciences，1993，90（2）：577-581.

[3] OFER A，KREFT J，LOGAN D T，et al.Implications of the inability of Listeria monocytogenes EGD-e to grow anaerobically due to a deletion in the class III NrdD ribonucleotide reductase for its use as a model laboratory strain.[J].Journal of bacteriology，2011，193（12）：2931-2940.

[4] 周? 云，潘? 蕾，郝春秋，等.單增李斯特菌作為疫苗載體的研究進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，2011（12）：1132-1134.