孫留霞,袁文菊,侯喜林

(1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程學(xué)院,河南 周口 466001;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus,BCV)是引起新生犢牛腹瀉和成年牛呼吸道疾病最主要的病原[1-2],目前還沒有特效的藥物治療BCV,接種疫苗是預(yù)防BCV有效途徑之一[3]。目前國內(nèi)外學(xué)者多數(shù)集中研究滅活疫苗,并注重超前免疫[3-4]。2002年,Keico[5]制備油乳劑滅活疫苗接種懷孕母牛,并進(jìn)行了田間試驗(yàn),使免疫母牛產(chǎn)生了較高的抗體水平,能有效預(yù)防BCV感染。本試驗(yàn)通過評(píng)價(jià)制備的BCV滅活疫苗的免疫效力,旨在為BCV疫苗的研制及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞 BCV-YC分離株、人直腸癌細(xì)胞(HRT-18)均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雌性小鼠,購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;產(chǎn)前兩個(gè)月齡健康妊娠母牛及六月齡健康育成牛,由周口市順達(dá)奶牛繁育中心提供。

1.3 疫苗制備 BCV-YC分離株在人直腸癌細(xì)胞(HRT-18)上培養(yǎng)增殖,收獲的病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融后(12 000 r/min離心10 min),收集上清病毒液,然后測定病毒感染力滴度為106.59TCID50/mL[6]。獲得的病毒液中加入甲醛溶液,使甲醛終濃度為0.05%(v/v),置于37℃搖床上滅活48 h。接種人直腸癌細(xì)胞(HRT-18)檢測滅活效果,然后按常規(guī)方法制備油乳劑疫苗[7],于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 疫苗檢驗(yàn)

1.4.1 物理性狀及無菌檢驗(yàn) 按文獻(xiàn)[7]所列的方法進(jìn)行外觀檢查、穩(wěn)定性檢測、劑型檢測及黏度檢查。另將制備的油乳劑滅活疫苗分別接種于馬丁肉湯、厭氧肉肝湯和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48～72 h,做無菌檢驗(yàn)[8]。

1.4.2 安全檢驗(yàn) (1)滅活效果檢查：取滅活后的病毒液,按100個(gè)TCID50/mL接種已生成良好HRT-18的細(xì)胞,72h內(nèi)觀察有無細(xì)胞病變。將細(xì)胞液傳代培養(yǎng)1次,72 h內(nèi)觀察有無細(xì)胞病變,若仍不出現(xiàn)細(xì)胞病變,認(rèn)為滅活完全。

(2)小鼠反應(yīng)：取5只8周齡健康小鼠,皮下接種2 mL/只疫苗,同時(shí)設(shè)鹽水對(duì)照,觀察14 d,檢查接種局部和小鼠全身的反應(yīng)。

1.5 小鼠免疫效力檢驗(yàn) 檢驗(yàn)合格的疫苗按以下方案接種8周齡健康小鼠,用間接ELISA抗體檢測方法進(jìn)行疫苗效力檢驗(yàn)。

1.5.1 不同佐劑的免疫效力比較 將24只8周齡雌性小鼠平均分為4組,分別免疫油乳佐劑疫苗、鋁佐劑疫苗、不加佐劑疫苗和生理鹽水。皮下多點(diǎn)注射0.3 mL/只,免2次,間隔期為3周。免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d,小鼠斷尾取血,分離血清,間接ELISA檢測。

1.5.2 不同劑量的免疫效力比較 將40只8周齡雌性小鼠平均分為4組,其中3組分別按0.1 mL、0.3 mL、1 mL不同劑量進(jìn)行腹腔接種小鼠,另外1組為空白對(duì)照組,共免兩次。免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d,小鼠斷尾取血,分離血清,間接 ELISA檢測。

1.5.3 不同免疫途徑的免疫效力比較 將18只8周齡雌性小鼠平均為3組,分別以最佳劑量按腹腔注射、皮下多點(diǎn)注射、大腿肌肉注射進(jìn)行兩次免疫。免后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d,小鼠斷尾取血,分離血清,間接ELISA檢測。

1.5.4 攻毒試驗(yàn) 攻毒前觀察疫苗免疫組和對(duì)照組小鼠的精神狀態(tài)以確定動(dòng)物的健康狀況。二免后第10天,免疫組和對(duì)照組腹腔注射最小致死量2倍量的病毒液。攻毒后,每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、發(fā)病情況3次。綜合分析攻毒組及對(duì)照組小鼠的的精神狀態(tài)、死亡數(shù)。求出疫苗的保護(hù)率=存活數(shù)/攻毒數(shù)×100%。

1.6 牛體免疫效力試驗(yàn)

地桃花提取物室內(nèi)抑制活性篩選結(jié)果顯示，地桃花提取物對(duì)10種供試植物的根、莖抑制效果不一致，高濃度比低濃度地桃花提取物對(duì)供試植物的抑制效果更強(qiáng)(表1)。在10 mg/mL地桃花提取物處理下，地桃花提取物對(duì)刺莧、稗的抑制效果最好，根長抑制率分別為74.42%、80.24%，莖長抑制率分別為93.63%、72.07%；對(duì)高粱、藜、水稗和千金子也有一定的根長抑制作用，抑制率介于50%～71%之間；而對(duì)香附子的根長抑制效果最差，根長抑制率僅為22.38%。

1.6.1 免疫抗體檢測 建立好的間接ELISA抗體檢測方法[9]和中和試驗(yàn)方法檢測牛只免疫抗體水平。

1.6.2 最小免疫劑量的確定 選擇6月齡健康育成牛8頭隨機(jī)分為4組。分別頸部肌肉注射2 mL、5 mL、10 mL BCV油乳劑滅活疫苗,對(duì)照組注射不含抗原的白油。首免后21 d后以同等劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后連續(xù)兩周每日觀察牛只注射部位局部反應(yīng)及有無全身癥狀。于免疫前和免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、60 d、72 d、90 d、120 d 采集血樣分離血清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 妊娠母牛免疫效力試驗(yàn) 把同期發(fā)情配種的荷斯坦孕牛12頭隨機(jī)分為3組,分別為頸部肌肉注射組、皮下注射組和對(duì)照組。免疫組牛在產(chǎn)前2月和1月分兩次免疫BCV滅活疫苗(5 mL/頭),對(duì)照組注射不含抗原的白油。分別于免疫前和免疫后 7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、60 d、72 d、90 d、120 d采集血樣分離血清-20℃保存。待母牛產(chǎn)犢后,立即哺犢牛以初乳,出生后8～10 h,用分離的牛冠狀病毒(YC株)攻毒,劑量為每頭口服2 mL 106.25TCID50/mL,記錄犢牛腹瀉表現(xiàn)及死亡情況,用已建立的RT-PCR方法[10]檢測糞便中的BCV。

2 結(jié)果

2.1 疫苗形狀及無菌檢驗(yàn) 疫苗外觀呈白色均質(zhì)乳劑,滴于蒸餾水中呈圓的油滴狀不分散。疫苗經(jīng)3 000 r/min離心15 min后,無分層和破乳現(xiàn)象。以出口內(nèi)徑為1.2 mm的1 mL吸管吸取疫苗1 mL,疫苗垂直流出0.4 mL的時(shí)間為(5±0.5)s。疫苗經(jīng)3種培養(yǎng)基培養(yǎng),均無細(xì)菌生長。

2.2 安全性檢驗(yàn)

2.2.1 滅活效果檢驗(yàn) 經(jīng)滅活檢驗(yàn)表明,細(xì)胞沒有出現(xiàn)病變,滅活完全。

2.2.2 小鼠反應(yīng) 用2 mL油乳劑滅活苗對(duì)小鼠進(jìn)行鼠急性腹腔下毒性試驗(yàn),2周內(nèi)3只小鼠均未出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀或死亡,說明該疫苗安全可靠。

2.2.3 牛體反應(yīng) 試驗(yàn)牛在15 d觀察期內(nèi),未見體溫升高等不良反應(yīng),注射部位吸收良好,說明30 mL及其以下注射劑量是安全的。

2.3 小鼠免疫效力檢驗(yàn) 通過對(duì)小鼠不同佐劑、不同免疫途徑和不同免疫劑量的免疫效力比較,可以看出免疫組小鼠在2次免疫后,均產(chǎn)生了高水平特異性抗體,油乳佐劑疫苗組和鋁佐劑疫苗組抗體水平差異不顯著(P＞0.05),油乳佐劑疫苗組和鋁佐劑疫苗組與無佐劑疫苗組抗體水平差異均為極顯著(P＜0.01),不同免疫途徑之間抗體水平差異不顯著。不同免疫劑量對(duì)抗體水平有著一定的影響,1 mL免疫組與0.3 mL組抗體水平差異不顯著(P＞0.05),但是這兩個(gè)劑量組與0.1 mL劑量組抗體水平差異均為極顯著(P＜0.01)(見圖1、2、3)。從攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果(見表1)計(jì)算出的保護(hù)率可以得出同樣的結(jié)論。

圖2 不同免疫途徑效果比較結(jié)果

2.4 疫苗免疫試驗(yàn)結(jié)果

圖3 不同免疫劑量效果比較結(jié)果

表1 不同劑量攻毒試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 最小免疫劑量的選擇 利用建立好的ELISA方法和中和試驗(yàn)方法對(duì)每組免疫牛血清抗體水平分別進(jìn)行檢測,可見免疫劑量為2 mL/頭時(shí),在免疫后第14天可產(chǎn)生一定的抗體;第42天達(dá)到峰值,但該峰值較低不足以產(chǎn)生有效的保護(hù)力;免疫劑量為5 mL/頭時(shí),在免疫后第7天就可產(chǎn)生一定的抗體;在免疫后第14天產(chǎn)生的抗體可己達(dá)到有效保護(hù),中和抗體第28天達(dá)到高峰,ELISA檢測產(chǎn)生的抗體OD值第42天達(dá)到高峰,可以產(chǎn)生有效的保護(hù)力;而免疫劑量為10 mL/頭試驗(yàn)組,雖然高于5 mL/頭組,但是差別不明顯。因而選擇疫苗的最小免疫劑量為5 mL/頭。

2.4.2 妊娠母牛免疫效力試驗(yàn)

2.4.2.1 ELISA檢測抗體結(jié)果 利用建立的ELISA抗體檢測方法對(duì)每組免疫妊娠母牛血清抗體水平分別進(jìn)行檢測,記錄數(shù)據(jù)見表2,兩種免疫途徑在第14天時(shí)就可以檢測到抗體,平均OD值分別為0.64±0.019、0.52±0.019均可以判定為陽性,在第42天時(shí)抗體達(dá)到最大值,隨后抗體緩慢下降,第120天仍能檢測到較高的抗體水平。

表2 免疫后的ELISA抗體檢測OD值平均水平

2.4.2.2 中和抗體的檢測結(jié)果 利用血清中和試驗(yàn)對(duì)免疫后不同天數(shù)的妊娠母牛采血進(jìn)行中和抗體的檢測,見表3。免疫后7 d中和抗體效價(jià)分別為1∶3.6 和 1∶2.0,小于 1∶4,判為陰性,第 14 天時(shí)為1∶8判為陽性。頸部肌肉注射組在42 d時(shí)達(dá)到高峰中和效價(jià)為1∶128,而皮下注射組在42 d時(shí)最大值為1∶64,此后中和抗體水平均呈下降趨勢,但是到第120天時(shí)仍達(dá)1∶32以上。

表3 免疫后誘導(dǎo)的中和抗體平均水平

2.4.2.3 攻毒試驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼喂初乳的免疫組沒有發(fā)生腹瀉,對(duì)照組犢牛則不同程度腹瀉,攻毒后2 d后從對(duì)照組犢牛排泄物中利用建立的RTPCR檢測方法檢測到陽性BCV。

3 討論

3.1 我們從豬冠狀病毒疫苗、犬冠狀病毒疫苗等其他動(dòng)物冠狀病毒疫苗的研究中發(fā)現(xiàn),油乳劑滅活疫苗可以有效防治動(dòng)物冠狀病毒感染。國內(nèi)學(xué)者謝敏康編譯的文章中報(bào)道,俄羅斯學(xué)者研制出防制新生犢牛腹瀉的四聯(lián)滅活苗[11]以及日本Keico[5]研究抗牛冠狀病毒感染的油佐劑疫苗均可以安全有效防制牛冠狀病毒感染,進(jìn)一步證明了油乳劑滅活疫苗有效預(yù)防BCV感染。

3.2 經(jīng)過對(duì)我們?cè)囍埔呙绲膶?shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果分析,所研制的滅活疫苗物理性狀良好,經(jīng)滅活效果及小鼠和牛只的安全性檢驗(yàn),證明制備的油乳劑滅活疫苗是安全的。國內(nèi)有相關(guān)報(bào)道小鼠感染牛冠狀病毒具有一定的敏感性[12],因此本文采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行效力研究,從本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,BCV滅活病毒接種小鼠后,可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。通過小鼠免疫保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果證明了制備的油乳劑滅活疫苗具有較高的免疫效力,在一定程度上肯定了制備的滅活疫苗的可行性和有效性。通過對(duì)小鼠不同佐劑、不同免疫途徑和不同免疫劑量的免疫效力比較,油乳佐劑疫苗組和鋁佐劑疫苗組抗體水平差異不顯著(P＞0.05),油乳佐劑疫苗組和鋁佐劑疫苗組與無佐劑疫苗組抗體水平差異均為極顯著(P＜0.01),不同免疫途徑之間抗體水平差異不顯著。不同免疫劑量對(duì)抗體水平有著一定的影響,1 mL免疫組與0.3 mL組抗體水平差異不顯著(P＞0.05),但是這兩個(gè)劑量組與0.1 mL劑量組抗體水平差異均為極顯著(P＜0.01)。

3.3 我們通過對(duì)育成牛的免疫劑量研究,確定了疫苗的最小免疫劑量為5 mL。我們用建立的間接ELISA檢測方法和傳統(tǒng)的病毒中和試驗(yàn)兩種方法檢測抗體水平并進(jìn)行相互比較驗(yàn)證。間接ELISA檢測結(jié)果可知,第14天時(shí)就可以檢測到一定抗體,在第42 d時(shí)抗體水平達(dá)到高峰,隨后抗體水平緩慢下降,但是到第120天仍可以檢測到比較高的抗體。中和試驗(yàn)結(jié)果表明,頸部肌肉注射組在42 d時(shí)達(dá)到高峰中和效價(jià)為1∶128,而皮下注射組在42 d時(shí)最大值為1∶64。此后中和抗體水平均呈下降趨勢,到第120天時(shí)仍可達(dá)1∶32以上。兩種方法檢測的結(jié)果呈平行關(guān)系,說明妊娠母牛接種BCV油乳劑滅活苗后可以產(chǎn)生了良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼喂初乳的犢牛沒有發(fā)生腹瀉,而對(duì)照組犢牛在攻毒12 h后不同程度發(fā)生腹瀉,證明了妊娠母牛初乳中產(chǎn)生的高水平BCV特異性抗體對(duì)預(yù)防犢牛的BCV感染有重要作用。不少國內(nèi)外學(xué)者研究報(bào)道了犢?？赏ㄟ^母源抗體獲得被動(dòng)免疫保護(hù)[13],國內(nèi)張儉偉等[4]把制備的牛輪狀病毒滅活苗接種懷孕母牛,初生犢牛通過母源抗體能有效抵抗牛輪狀病毒感染。

3.4 由于試驗(yàn)條件和時(shí)間的限制,免疫的牛體個(gè)數(shù)有限,在以后的擴(kuò)大田間免疫試驗(yàn)中我們會(huì)進(jìn)一步結(jié)合養(yǎng)牛生產(chǎn)實(shí)際,制定科學(xué)、合理的免疫程序,為BCV油乳劑滅活疫苗的市場化應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。