劉長清,黃秀英,李成山,岳豐雄,丁 莉,邢 剛

(1.北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司,北京 平谷 101206;2.成都天邦生物制品有限公司,四川 成都 610100)

新城疫(ND)是由雞新城疫病毒(NDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染性疾病,給世界各國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失[1]。分子流行病學調查結果顯示,近年來我國新城疫流行毒株以基因Ⅶ型為主,與我國目前廣泛使用的疫苗株LaSota和Clone 30(均屬于基因Ⅱ型)等存在明顯差異,雖然雞群在整個飼養(yǎng)期內進行過多次常規(guī)疫苗免疫,但仍有感染強毒株引起流行的可能性,臨床上主要表現(xiàn)為非典型性新城疫的發(fā)生[2-6]。因此開發(fā)免疫原性更好、與目前流行株更匹配的疫苗已成為新城疫疫苗研發(fā)的趨勢和當務之急。中國農業(yè)大學對分離到的基因 VII型毒株 Chicken/Shandong/SG10/2010株(簡稱SG10株)進行基因工程操作,成功獲得1株致弱株aSG10株,該毒株具有良好的安全性和免疫原性[6]。

H9亞型禽流感自1994年我國首次報道后,廣泛流行于多個省份,盡管采取多種措施,但該病仍對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失[1]。分子流行病學調查結果顯示,近年分離株與早期疫苗株HA基因遺傳進化距離不斷加大,同源性不斷降低,現(xiàn)有疫苗對流行株的保護力逐漸下降,疫苗株應當進行更新[4-5,7]。中國農業(yè)大學通過對大量分離株進行試驗,篩選得到一株免疫原性較好的毒株：A/chicken/Hebei/G/2012(H9N2)株(簡稱G株)。

本試驗對雞新城疫(基因Ⅶ型)、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗(aSG10株+G株)(簡稱“二聯(lián)苗”)對蛋雞的安全性、免疫效力和免疫持續(xù)期進行評價,對二聯(lián)苗試驗數據進行完善,對蛋雞合理使用該疫苗提供科學依據。

1 材料

1.1 試驗疫苗 雞新城疫(基因Ⅶ型)、禽流感(H9亞型)二聯(lián)滅活疫苗(aSG10株+G株)中間試制產品,由成都天邦生物制品有限公司滅活疫苗GMP車間胚毒滅活疫苗生產線試制生產,批號為試201502。

1.2 試驗雞 京紅1號蛋雞,為北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司飼養(yǎng)。

1.3 HI抗原及攻毒用毒株 NDV aSG10株和H9亞型AIV G株HI抗原,NDV強毒株SG10株和H9亞型AIV G株,均由中國農業(yè)大學制備、提供。

1.4 隔離器 雞飼養(yǎng)隔離器,取得北京市實驗動物使用許可證,由中國農業(yè)大學提供。

2 方法

2.1 安全性試驗 進行單劑量、超劑量免疫安全性試驗。

2.1.1 單劑量免疫安全性試驗 取115日齡京紅1號蛋雞400只,隨機分為2組,200只/組,分別以頸部皮下和腿部肌肉免疫二聯(lián)苗,0.5 mL/只,另取100只不免疫作為空白對照,免疫后每日觀察試驗雞的臨床癥狀。統(tǒng)計免疫后28 d和56 d蛋雞的產蛋情況,并于免疫后28 d,每組隨機剖檢20只,觀察注射部位疫苗的吸收、殘留情況和是否存在炎性反應。

2.1.2 超劑量免疫安全性試驗 取115日齡京紅1號蛋雞400只,隨機分為2組,200只/組,分別以頸部皮下和腿部肌肉免疫二聯(lián)苗,1.0 mL/只,另取100只不免疫作為空白對照,免疫后每日觀察試驗雞的臨床癥狀,統(tǒng)計免疫后28 d和56 d蛋雞的產蛋情況,并于免疫后28 d,每組隨機剖檢20只,觀察注射部位疫苗的吸收、殘留情況和是否存在炎性反應。

2.2 免疫效力試驗

2.2.1 免疫及分組 取115日齡京紅1號蛋雞5 000只,經頸部皮下途徑免疫二聯(lián)苗,0.5 mL/只,同時取100只不免疫作為對照雞。

2.2.2 抗體檢測 分別于免疫前、免疫后2周、4周、6周、8周、10周、3個月、4個月、5個月、6個月進行采血,每次分別從免疫試驗組和空白對照組隨機抽取30只雞和10只雞,進行采血、分離血清,分別測定NDV和H9亞型AIV的HI抗體。

2.2.3 攻毒試驗 分別于免疫后21日齡和免疫后6個月,從試驗雞中隨機抽取40只免疫雞和10只對照雞,免疫試驗組隨機分為2組,20只/組,分別進行新城疫攻毒保護試驗和禽流感(H9亞型)攻毒保護試驗,同日齡對照雞各5只作為攻毒空白對照組。

2.2.3.1 新城疫攻毒試驗 免疫雞20只連同對照雞5只,每只雞各肌肉注射NDV SG10株0.2 mL(含105.0ELD50),攻毒后觀察14 d,記錄雞只發(fā)病和死亡情況。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子進行病毒分離,對病毒分離陰性的樣品,應盲傳1次后再進行判定,以免疫攻毒雞不發(fā)病、不死亡且病毒分離陰性判為保護,免疫組應至少70%保護。

2.2.3.2 禽流感(H9亞型)攻毒保護試驗 免疫雞20只連同對照雞5只,每只雞各靜脈注射H9亞型AIV G株0.2 mL(含106.0EID50),攻毒后5 d采集每只雞咽喉拭子利用雞胚法進行病毒分離,對病毒分離陰性的樣品,應盲傳1次后再進行判定,以試驗雞病毒分離陰性判為保護,免疫組應至少90%保護。

3 結果

3.1 安全性試驗

3.1.1 單劑量免疫安全試驗 二聯(lián)苗經頸部皮下注射和肌肉注射途徑單劑量接種115日齡蛋雞,接種后觀察56 d,試驗雞全部健活,采食、飲水、精神均正常,未見任何不良反應。免疫后28 d剖檢可見接種部位無炎癥、無結節(jié)、疫苗吸收良好。免疫后28 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為27.0%和27.3%,空白對照組為27.2%,各組均無顯著差異;免疫后56 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為93.4%和93.6%,空白對照組為93.7%,各組均無顯著差 異,結果見表1。

表1 單劑量接種對蛋雞的安全試驗

3.1.2 超劑量接種安全試驗 二聯(lián)苗經頸部皮下注射和肌肉注射途徑超劑量接種115日齡蛋雞,接種后觀察56 d,試驗雞全部健活,采食、飲水、精神均正常,未見任何不良反應。免疫后28 d剖檢顯示,經2種途徑接種疫苗后,均吸收良好,注射部位無明顯炎癥反應和結節(jié)(見中插彩版圖1)。免疫后28 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為27.5%和27.8%,空白對照組為27.4%,各組均無顯著差異;免疫后56 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為94.1%和93.7%,空白對照組為93.8%,各組均無顯著差異,結果見表2。

表2 超劑量接種對蛋雞的安全試驗

3.2 免疫效力試驗

3.2.1 抗體檢測 免疫前,雞群NDV HI抗體平均滴度為8.1 log2,免疫后2周,HI抗體平均效價為10.9 log2,免疫后4周 HI抗體滴度達到高峰為11.0 log2,至免疫后6月,NDV HI抗體平均效價不低于6.0 log2;免疫前雞群H9 HI抗體平均滴度為10.3 log2,免疫后2周,HI抗體平均效價為9.1 log2,至免疫后6月,HI抗體平均效價均不低于7.0 log2。空白對照組雞群不論是NDV HI抗體還是H9 HI抗體均一直下降,至免疫后6個月分別下降至1.9 log2和3.9 log2。結果見表3和圖2。

3.2.2 攻毒試驗 免疫后21日及免疫后6個月,對免疫雞進行攻毒,NDV和H9免疫攻毒組存活率達20/20,保護率均在90%以上。不免疫對照雞在免疫后21日,對NDV的攻毒保護為5/5,對H9亞 型AIV的攻毒保護為5/5,但在免疫后6個月,對NDV的攻毒保護率為3/5;對H9亞型AIV保護率為1/5。結果見表4。

表3 蛋雞免疫后HI抗體消長情況

圖2 蛋雞免疫受試疫苗(試201502)后ND(A)和H9(B)抗體消長情況

4 討論

新城疫與H9亞型禽流感是危害我國禽業(yè)的兩大疾病,對養(yǎng)禽業(yè)可造成巨大經濟損失。對于新城疫,雖然不同基因型疫苗均能保護SPF雞抵抗基因Ⅶ型強毒株的致死性攻擊,但基因Ⅶ型新城疫疫苗能顯著降低免疫雞強毒感染后的排毒率和排毒量,在臨床上可有效控制免疫雞群中非典型新城疫的發(fā)生[2,8]。中國農業(yè)大學多年來對H9亞型禽流感的疫情動態(tài)進行跟蹤調查,積累了大量臨床分離株,通過交叉免疫保護試驗篩選出一株免疫原性較好的病毒株G株,前期試驗結果表明,該毒株對不同時期流行毒株均有較好的保護作用,可用于滅活疫苗的研制[9]。

本試驗使用新城疫基因Ⅶ型人工致弱毒株aSG10株及H9亞型禽流感流行毒株G株,制備的二聯(lián)疫苗,在蛋雞上進行了安全性和效力研究。安全性試驗結果表明,二聯(lián)苗經皮下或肌肉途徑單劑量、超劑量接種蛋雞后,未對雞群造成明顯的全身和局部不良反應,雞群產蛋率均與對照無明顯差異,說明該疫苗具有良好的安全性。

表4 免疫后不同時間攻毒保護結果

HI抗體水平的高低是評估疫苗保護效果的一個重要因素。在實際生產中,常用血清學方法替代免疫攻毒法來衡量疫苗接種后的免疫力。通常認為疫苗免疫后雞群特異性抗體水平越高,雞群抵抗相應病毒感染的能力越強。蛋雞常規(guī)免疫程序中,小日齡時需免疫新城疫及H9亞型禽流感相關疫苗,產蛋前(110～130日齡)加強免疫1次,因本試驗效力研究是在產蛋前進行,空白對照組因小日齡時進行過相關疫苗免疫,仍有一定抗體滴度,但試驗雞在免疫二聯(lián)苗后抗體明顯提高,且免后6個月仍保持在保護水平(ND-HI抗體≥6.0 log2,H9-HI抗體≥7.0 log2)以上,而空白對照組則持續(xù)下降。攻毒保護試驗顯示,免后6個月新城疫攻毒保護率為100%,禽流感攻毒保護率為90%。表明該二聯(lián)苗的免疫效果良好,免疫持續(xù)期長。