馮 杰,喬建頂,張美玲,趙 月,王新衛(wèi)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院禽病研究所,河南 鄭州 450002;2.洛陽市喬哥農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,河南 洛陽 471000)

筆者在臨床中遇到一例綠翅金剛鸚鵡感染ABV的疑似病例,經(jīng)過臨床流行病學(xué)、剖檢變化和RT-PCR檢測ABV核酸,證實該鸚鵡感染禽波納病毒(ABV)。報告如下。

1 病例基本信息

2018年3月23日,洛陽一鸚鵡養(yǎng)殖戶帶一死亡綠翅金剛鸚鵡到河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所就診。該戶養(yǎng)鸚鵡15種,共158只,均未防疫任何疫苗。主訴：發(fā)病鸚鵡多為綠翅金剛、藍(lán)黃金剛大型鸚鵡,而其他品種鸚鵡未出現(xiàn)異常。病死鸚鵡其病初嘔吐不止,食欲下降,消化不良,拉原糧或墨綠色糞(見中插彩版圖1),有時便血,或伴有搖頭、撞頭等神經(jīng)癥狀。隨病程發(fā)展,鸚鵡體質(zhì)漸變?nèi)?精神沉郁,最后衰竭而亡。飼養(yǎng)者曾經(jīng)治療發(fā)病鸚鵡,使用方案為抗病毒輸液、補(bǔ)充生理鹽水等,但無明顯效果。

2 臨床剖檢

病理剖檢顯示,病死鸚鵡機(jī)體消瘦明顯,龍骨外露,胸部肌肉深陷(見中插彩版圖2);腺胃擴(kuò)張明顯(見中插彩版圖3),膨大至原來的5～10倍,甚至占據(jù)整個腹腔;胃壁薄,腺胃乳頭消失(見中插彩版圖4),內(nèi)有未消化食物;胰臟有白色壞死灶,心包少量積液,見腦淤血。未見其他變化。結(jié)合臨床癥狀和剖檢變化,初步疑為腺胃擴(kuò)張性疾病(PDD),后進(jìn)一步進(jìn)行實驗室診斷。

3 實驗室診斷

3.1 RNA的提取 無菌采集病死鸚鵡腦,腺胃,肝臟,腎臟,肺臟等多個部位的器官,將各個部位器官混合制成樣品懸液,反復(fù)凍融3次,離心取上清。抽取上清加入 TRIZol組織裂解液緩慢混勻后靜止5 min,再加入氯仿沉淀15 min后10 000 r/min離心15 min取上清,加入等體積的異丙醇緩慢混勻靜止30 min,10 000 r/min離心15 min棄上清,加入75%乙醇沉淀5 min后風(fēng)干,干燥后溶于30 μL DEPC水(1∶1 000稀釋)中備用。緊接著采用二步轉(zhuǎn)錄法將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA,方便下一步使用。

3.2 反轉(zhuǎn)錄 在EP管中依照表1配制模板RNA引物混合液,后在70℃保溫10 min后在冰上急冷2 min以上。后依照表2在原EP管中配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。然后以30℃預(yù)熱10 min,42℃保溫1 h,75℃反應(yīng)15 min后低溫冷卻,得到的cDNA溶液用于PCR擴(kuò)增。

表1 模板RNA引物混合液

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液

3.3 PCR鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[1]設(shè)計合成禽波納病毒N 基因引物,F：5′-GGCAAGGTAATYGTCCCTGGATGGC-3′;R： 5′-CCAACACCAATGTTCCGA AGCCGAT-3′。預(yù)計擴(kuò)增片段長度為221 bp。然后以Mix復(fù)合反應(yīng)酶12.5 μL,雙蒸水8.5 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 模板 3 μL,配制成 25 μL 的反應(yīng)體系,經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行DNA凝膠電泳分析。經(jīng)電泳跑膠后可知在221 bp左右出現(xiàn)明顯的目的條帶(圖5),與目的條帶位置相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒全部回收,克隆入pMD18-T質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α內(nèi),涂布到氨芐抗性平板過夜,挑取陽性單菌落,小劑量提取重組質(zhì)粒,鑒定的陽性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果的Blast分析顯示,該基因在進(jìn)化上處于鸚鵡波納病毒4型毒株分支,其基因序列與鸚鵡波納病毒4型(NCBI登錄號：KU748823.1)N基因同源性為96%,因此確定送檢的金剛鸚鵡感染了鸚鵡波納病毒4型。

圖5 ABV-N基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

4 討論

禽波納病毒(Avian Borna Virus,ABV)是一種高度精神嗜性的單股負(fù)鏈RNA病毒,是導(dǎo)致鳥類腺胃擴(kuò)張性疾病(Proventricular Dilatation Disease.PDD)的主要病原體[2]。該病于20世紀(jì)70年代在金剛鸚鵡身上發(fā)生,被認(rèn)為是鸚鵡種群中嚴(yán)重甚至是致命的神經(jīng)退行性疾病[2-4]。目前,因廣泛的商貿(mào)往來,PDD在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,受感染的鳥類除了鸚鵡之外,加拿大鵝、鴕鳥、番鴨、鴿、鷯哥、密雀、織雀、金絲雀及其他雀形目鳥類等50多種鳥類中也有檢出ABV的報道[5-7]。當(dāng)前流行病學(xué)和試驗數(shù)據(jù)表明,禽波納病毒是一種高度精神嗜性的單股負(fù)鏈RNA病毒,是鸚鵡科鳥類的腺胃擴(kuò)張癥(PDD)的致病因子[8-9],此病毒具有廣泛的組織嗜性,主要影響上消化道和中消化道的自主神經(jīng),包括食道,前胃,腦室和十二指腸[10]。腺胃影響最為明顯,不能進(jìn)行正常的蠕動消化,從而導(dǎo)致食物積壓,腺胃膨大,糞便中未消化食物的存在。此外,病毒還侵入腦部神經(jīng),引起一定的中樞神經(jīng)癥狀,如撞頭,共濟(jì)失調(diào)等。筆者此次病例的臨床表現(xiàn)與此相符,內(nèi)臟器官的病理變化暗示送診鸚鵡感染了ABV,基因測序證實此病例鸚鵡感染的為ABV-4型,屬于目前全球流行報道較多的為2型、3型和4型中之一種。臨床問診鸚鵡飼養(yǎng)主,知發(fā)病鸚鵡在我國多地有巡回演出,其感染發(fā)病時間不十分清楚。但該場內(nèi)的其他類鸚鵡不曾出現(xiàn)該病,這是不是預(yù)示大型鸚鵡對ABV更為敏感,仍需流行病學(xué)證據(jù)。

目前,自然發(fā)病的PDD在全球多個地區(qū)都有報道,但是中國內(nèi)陸還未有自然感染的病例報道出現(xiàn),ABV感染引起鸚鵡PDD的自然案例也無報道。筆者的臨床案例首次證實ABV亦在中國內(nèi)陸有傳播。這種病毒在國內(nèi)的傳播程度、經(jīng)何種方式傳入國內(nèi)以及會給寵物鳥類行業(yè)、甚至家禽行業(yè)帶來何種影響還未可知,仍需進(jìn)一步流行病學(xué)評估。