余 仁,許雅婷,陳金軍,王曉麗,張永鑫

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.湖北省武漢市亞博特實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430065)

副豬嗜血桿菌(HPS)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展病原菌之一,其主要引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的疾病。近年來(lái)該病在集約化豬場(chǎng)內(nèi)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì),主要引起從哺乳到保育不同階段仔豬死亡、生長(zhǎng)發(fā)育不良、飼料利用率降低等問(wèn)題。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬的一種急性傳染病,其臨床癥狀主要表現(xiàn)為腸炎、腸毒血癥等。本文對(duì)副豬嗜血桿菌病和豬致病性大腸桿菌病在湖南地區(qū)豬場(chǎng)的發(fā)生情況及耐藥程度進(jìn)行了檢測(cè)和篩查,以期對(duì)綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株的采集與鑒定 病料包括患病豬(或病死豬)的肺臟、氣管、關(guān)節(jié)、腸道等組織器官,來(lái)源于湖南新湘農(nóng)牧業(yè)、湖南大康牧業(yè)等公司的豬場(chǎng)。共分離鑒定出58株副豬嗜血桿菌、52株大腸桿菌。分別在無(wú)菌條件下取病變組織或炎性液體涂布于血平板和S.S.平板,37℃培養(yǎng)18 h、24 h,挑取單菌落分別接種至PPLO肉湯(含NAD)和TSB肉湯進(jìn)行純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,通過(guò)PCR擴(kuò)增并結(jié)合生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 血平板和S.S.平板,購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。PPLO瓊脂、胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)均為OXOID公司產(chǎn)品。新鮮牛血清為杭州四季青材料有限公司產(chǎn)品,使用前經(jīng)56℃滅活30 min。輔酶I(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,NAD)為Omega公司產(chǎn)品。微量生化鑒定試劑為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。PCR分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3 藥敏紙片藥敏試驗(yàn)受試藥物包括：阿米卡星(Amikacin,AN)、氨芐西林(Ampinillin,AM)、頭孢噻肟(Ceftiofur,EFT)、頭孢拉定(Cefradine,CEF)、阿莫西林(Amocillin,AMX)、諾氟沙星(Enrofloxacin,ENR)、紅霉素(Erythromycin,E)、氟苯尼考(Florfenicol,FFC)、慶大霉素(Gentamicin,GM)、阿奇霉素(Azithromycin,AZI)、林可霉素(Lincomycin,L)、四環(huán)素(Tetracycline,TET)、泰利霉素(Tiamulin,TIA)、替米考星(Tilmicosin,TIL)、強(qiáng)力霉素(Doxycycline,DO)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)。所用紙片,均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)以美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》2010版(CLSI-M100-S20)為指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,采用紙片擴(kuò)散法,測(cè)定58株副豬嗜血桿菌和52株大腸桿菌對(duì)16種抗菌藥的敏感性。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn) 參照CLSI-M100-S20文件執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)抑菌圈直徑大小將細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性分為敏感、中介、耐藥3種形式。

2 結(jié)果與討論

兩類細(xì)菌對(duì)不同藥物的耐藥情況以及總體情況見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)58株副豬嗜血桿菌菌株對(duì)氟苯尼考(94.8%)、四環(huán)素(93.1%)、阿奇霉素(91.4%)敏感率高;敏感率較高的有阿米卡星(89.6%)、頭孢拉定(89.6%)、紅霉素(89.6%)、氨芐青霉素(87.9%)、強(qiáng)力霉素(87.9%)、慶大霉素(84.5%)和替米考星(84.5%);阿莫西林和林肯霉素的耐藥率分別高達(dá)25.9%和29.3%。

大腸桿菌菌株對(duì)氨芐青霉素(88.5%)耐藥率較高,對(duì)泰利霉素(73.1.3%)、阿奇霉素(71.1%)、強(qiáng)力霉素(71.1%)、紅霉素(69.5%)、林肯霉素(69.2%)、替米考星(67.3%)、頭孢拉定(63.5%)、四環(huán)素(63.5%)也有一定的耐藥性。對(duì)阿莫西林和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為5.8%和21.2%。

表1 110株臨床致病菌對(duì)不同抗菌藥的敏感度

對(duì)兩類致病菌多重耐藥性進(jìn)行分析顯示,副豬嗜血桿菌在耐藥數(shù)為0～16的區(qū)間上沒(méi)有明顯規(guī)律性,呈近似彌散性分布。大多數(shù)菌株能耐受1～2種藥物,少數(shù)對(duì)多重藥物仍具有一定的耐藥性(見(jiàn)圖1)。

綜上所述,我國(guó)湖南地區(qū)從2016年1～12月分離的58株HPS和52株E.coli的耐藥性,反映當(dāng)前湖南地區(qū)這2種致病菌的耐藥特點(diǎn),進(jìn)一步為豬場(chǎng)生產(chǎn)臨床用藥提供較為詳實(shí)準(zhǔn)確的參考,具有一定的臨床應(yīng)用意義。

圖1 兩類臨床致病菌的多重耐藥性