梅 力,楊春江,韋海濤,于在江,李志軍,陳會玲,楊小強,高曉龍,王 林,馮小宇

(1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心,北京 大興 102629;2.北京納百生物科技有限公司,北京 大興 100176)

牛病毒性腹瀉病(BVD),又稱為黏膜病,是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)所引起的,以急慢性黏膜病、持續(xù)性感染和免疫抑制為主要特征的病毒性傳染病。BVD的流行范圍廣,感染率高,我國目前己有20多個省市自治區(qū)存在該病。華中農(nóng)業(yè)大學鄧明亮等于2010-2013年間采集了全國8個省份的奶牛、肉牛、牦牛和水牛血清,經(jīng)檢測BVDV整體抗體陽性率高達58.09%,4種牛分別的抗體陽性率為89.49%,63.27%,45.38%和14.18%。翁曉剛等于2010-2013年間對北京部分牛場流行病學調(diào)查顯示,牛群中抗體陽性率高達94.1%[1]。BVD沒有特征性的臨床癥狀,往往以持續(xù)性感染的形式存在,并且持續(xù)性感染牛不能建立免疫反應(yīng)而終身帶毒、排毒,因牛只在臨床上無典型性癥狀,加上BVDV往往與其他病原混合感染或?qū)е吕^發(fā)感染,以上表明,BVD對牛養(yǎng)殖業(yè)造成的隱性損失是非常巨大的,我國BVD防控形勢十分嚴峻[2]。

膠體金技術(shù)自1971年被引入到免疫化學中,作為一種免疫標記技術(shù)而被使用。膠體金作為標記物不存在內(nèi)源酶干擾及放射性同位素污染的問題,且利用不同顆粒大小的膠體金還可以做雙重甚至多重標記,使定位更加精確。由于膠體金作為標記物有很多優(yōu)點,因此自該技術(shù)問世以來在國內(nèi)外的許多研究領(lǐng)域中得到了迅速的發(fā)展[3]。P80蛋白是常用的診斷蛋白,目前已有商品化的ELISA試劑盒基于該蛋白,但膠體金檢測還未見報道;雖然利用病毒分離培養(yǎng)、免疫熒光、ELISA和PCR等方法開展牛病毒性腹瀉檢測的研究已有報道[4-7],但這些傳統(tǒng)方法均需依賴專業(yè)的儀器設(shè)備及專業(yè)實驗人員,且操作費時費力,無法在基層養(yǎng)殖場廣泛開展。本研究采用重組表達的BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白P80,建立雙抗原夾心膠體金檢測試紙條,為基層疫情防控提供了有效的檢測手段,可用于各種規(guī)模養(yǎng)殖單位的整體篩查和凈化,極大地改善了當前BVDV的防控狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 試驗用標準陰、陽性血清來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。BVDV病毒及待測血清樣本由本實驗室保存。

1.2 主要儀器設(shè)備 PCR儀(Thermo公司);純水儀(密理博公司);培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司);紫外分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司);凝膠成像系統(tǒng)(北京昊諾斯科技有限公司);天平(賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司);蛋白純化儀(GE primer公司);膠體金切條機(上海韓感電子有限公司);劃膜儀(Biodot公司);膠體金讀數(shù)儀(自制)、超聲破碎儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.3 主要試劑及材料 質(zhì)粒pMD18-T-D(D基因片段包括BVDV的4691-7488堿基)由本實驗室構(gòu)建、DH5α感受態(tài)細胞,購自北京天根生物科技有限公司;桿狀病毒表達載體pFastBac HT-B、DH10Bac感受態(tài)細胞由本實驗室保存、羊抗牛二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);氯金酸(Sigma公司);蛋白穩(wěn)定劑(上海西寶生物科技有限公司);NC膜及其他膠體金材料(上海捷寧生物工程有限公司)。

牛病毒性腹瀉P80抗體檢測試劑盒(貨號：P00645-5,美國 IDEXX)。

其他試劑均來自國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.4 P80重組蛋白桿狀病毒系統(tǒng)表達 參照Gen-Bank中登錄的BVDV基因序列設(shè)計引物,用于克隆P80基因片段,在上、下游引物中引入了BamH I和X ho I酶切位點,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P80基因片段以pMD18-T-D質(zhì)粒為模板,用PCR方法擴增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,退火條件為55.6℃ 45 s,72℃延伸2 min,30個循環(huán)后,再72℃延伸7 min;4℃終止反應(yīng)。純化的PCR產(chǎn)物與表達載體pFast-Bac HT-B分別進行雙酶切后,用T4 DNA連接酶4℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。陽性重組質(zhì)粒命名為pFastBac HT-P80B。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)座DH10Bac感受態(tài)細胞,通過用KTG抗生素和藍白斑篩選陽性克隆,提取Bacmid,轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞,觀察轉(zhuǎn)染后的細胞病變并收集重組桿狀病毒。

將細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液煮樣后進行SDS-PAGE電泳,對重組表達蛋白進行鑒定;將蛋白樣品完成SDS-PAGE后進行轉(zhuǎn)膜操作,通過濕法轉(zhuǎn)印至NC膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后加入一抗(BVDV陽性血清,1∶100稀釋)和二抗(兔抗牛IgG HRP,1∶3 000稀釋),最后加入底物顯色。

1.5 P80蛋白純化鑒定 將重組桿狀病毒以MOI 0.1感染sf9昆蟲細胞,4 d后5 000 r/min離心10 min收集上清。目的蛋白的純化參照Ni-NTA純化系統(tǒng)說明書進行,純化后的蛋白用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量后分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第二，要對施工設(shè)備和施工技術(shù)方案進行控制，結(jié)合高速公路橋梁施工實際要求和質(zhì)量標準，完善階段性施工設(shè)備管理流程，要強化技術(shù)人才管理和工作人員能力培養(yǎng)工作，充分挖掘人力管理工作的時效性價值，合理創(chuàng)新施工技術(shù)方法，實現(xiàn)設(shè)備管理和整體施工效率提升奠定基礎(chǔ)。除此之外，也要對人員進行集中培訓，按照方案有序推動設(shè)備管理和方案監(jiān)督工作[7]。

1.6 P80蛋白膠體金標記 采用檸檬酸三鈉還原法制備得到40 nm的膠體金顆粒溶液,調(diào)節(jié)pH值至9.0備用。取一定量的膠體金顆粒溶液,置于磁力攪拌器上,然后將純化后的蛋白抗原P80以PBS按照1∶2 000的比例稀釋后加入膠體金溶液中攪拌反應(yīng)60 min,然后將PEG 20 000溶液加入混合反應(yīng)液中,使PEG的最終濃度約為1%,置于冷凍離心機(4℃)上慢速(速度為11 000r/min～13 000 r/min)離心10 min后棄去上清液。將下層沉淀用PBS反復(fù)洗滌并繼續(xù)離心棄去多余上清液。最后將沉淀物以PBS緩沖液重新懸浮,使最終的蛋白濃度約為50 μg/mL左右,保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 BVDV雙抗原夾心膠體金檢測方法的建立

1.7.1 金標墊的制備 金標墊采用聚酯膜,經(jīng)含有1%BSA和1%吐溫-20的PBS處理后,將制備好的膠體金標記抗原按照40 μL噴涂,完畢,37℃烘干2 h備用。

1.7.2 樣品墊的制備 樣品墊采用聚酯纖維墊,采用自制含有表面活性劑的處理液浸泡后烘干備用。

1.7.3 檢測線和質(zhì)控線包被 檢測限標記物為檢測抗原,質(zhì)控線標記物為羊抗牛二抗。分別將檢測抗原和羊抗牛二抗用含有1%BSA的PBS稀釋成濃度為0.9 mg/mL和1.1 mg/mL溶液,然后用Biodot劃膜儀噴涂于硝酸纖維膜上,完畢,37℃度烘干1 h備用。

1.7.4 試紙條組裝 試紙條的組裝按照如下(圖1)模式進行。其中PVC背板、吸水墊為常規(guī)材料組裝好的大板用切條機切成7 mm的裸條備用。

圖1 膠體金試紙條組裝圖

1.7.5 試紙條檢測 將待測樣本以PBS稀釋100倍即可用于檢測。檢測時取200 μL稀釋好的樣本至反應(yīng)微孔中,插入試紙條,確保金標端插入液面,計時5 min后觀察結(jié)果。陰性：質(zhì)控線顯色,而檢測限不顯色;陽性：質(zhì)控線顯色,而檢測限也顯色。超過10 min觀察結(jié)果無效。

(1)靈敏度檢測：將標準陽性血清和標準陰性血清用 PBS 按照1∶10,1∶50,1∶100,1∶500,1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000稀釋,用本研究制備的試紙條進行檢測,將膠體金試紙條能夠檢測出的最高稀釋度作為該試紙條的靈敏度。

(2)特異性檢測：口蹄疫病毒(FMDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)的陰性血清和陽性血清由本實驗室保存,用建立的膠體金試紙條對以上兩種病毒的陰、陽性血清進行特異性交叉試驗,同時設(shè)標準陰、陽性血清對照,以判定該試紙條的特異性。

(3)穩(wěn)定性檢測：將研制的試紙條分別置于-20℃、室溫、37℃持續(xù)保存7 d。7 d后取出,檢測稀釋100倍的標準陽性血清和陰性血清,單個樣本重復(fù)5次,以檢測結(jié)果的一致性來評判該試紙條的穩(wěn)定性。

1.8 與國外試劑盒的對比試驗 選取80份牛血清樣品,使用建立的膠體金試紙條和IDEXX牛病毒性腹瀉ELISA抗體檢測試劑盒同時進行檢測,分別計算陰、陽性樣本的符合率,對試紙條的檢測效果進行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 P80蛋白重組表達及純化鑒定 陽性重組質(zhì)pFastBac HT-p80PCR的鑒定結(jié)果如圖2,其中1、2、3為陽性重組質(zhì)粒,4、5為陰性克隆;經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定顯示,昆蟲細胞系統(tǒng)正確重組表達了P80蛋白,其蛋白分子量為76 kDa,如圖3和圖4。

圖2 重組質(zhì)粒pFastBac HT-P80的鑒定

2.2 P80蛋白膠體金標記 使用膠體金顆粒對制備的P80蛋白進行標記,調(diào)節(jié)蛋白終濃度為50 μg/mL,標記的P80蛋白可穩(wěn)定保存于4℃。

圖3 重組P80蛋白SDS-PAGE電泳圖

圖4 重組P80蛋白的Western Blot鑒定圖

2.3 膠體金檢測方法的建立

2.3.1 膠體金的檢測結(jié)果 膠體金試紙條對BVDV陽性血清和陰性血清的檢測結(jié)果如中插彩版圖5所示。其中A為試紙條的質(zhì)控條線,B為陽性血清的檢測結(jié)果條線,C為陰性血清的檢測結(jié)果條線。

2.3.2 靈敏度 將標準陽性血清用PBS按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀釋,用以評價膠體金試紙條的靈敏度,從表1可知,當標準陽性血清稀釋至1∶500時,膠體金試紙條的檢測結(jié)果為陽性,而稀釋至1∶1 000時,膠體金試紙條的檢測結(jié)果為陰性,表明本研究制備的膠體金試紙條的檢測靈敏度為標準陽性血清稀釋至 1∶500。

表1 BVDV抗體膠體金試紙條敏感性試驗結(jié)果

2.3.3 特異性 使用建立的膠體金試紙條對FMDV、IBRV的陽性血清和陰性血清進行檢測,檢測結(jié)果均為陰性,如表2,說明本試紙條對這幾種疫病抗體無交叉反應(yīng),可以特異地識別BVDV抗體。

表2 BVDV抗體膠體金試紙條特異性試驗結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性 將不同溫度儲存的試紙條分別用標準陽性血清和標準陰性血清進行檢測,如表3。檢測結(jié)果表明,低溫凍存對試紙條的檢測結(jié)果影響較大,而室溫和37℃對試紙條檢測結(jié)果無影響,說明試紙條具有較好的穩(wěn)定性。2.4 與國外試劑盒檢測結(jié)果對比 使用IDEXX P80抗體檢測試劑盒和建立的膠體金試紙條對80頭份牛血清樣本進行重復(fù)檢測,從結(jié)果中可看出,使用膠體金試紙條檢測出陽性樣品26份,陽性檢出率為32.5%,檢測出陰性樣品54份,陰性檢出率為67.5%。而用IDEXX P80抗體檢測試劑盒檢測出陽性樣品30份,陽性檢出率為37.5%,檢測出陰性樣品為50份,陰性檢出率為62.5%。其中兩種方法檢測共為陽性的樣品為26份,共為陰性的樣品為50份,即陽性符合率為86.7%,陰性符合率為100%,總符合率為95%,可見制備的膠體金試紙條與商品化的ELISA試劑盒具有著較高的符合率,符合率結(jié)果見表4。

表3 BVDV抗體膠體金試紙條穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表4 BVDV抗體膠體金試紙條與IDEXX抗體檢測_____________試劑盒符合率的比較

3 討論

牛病毒性腹瀉病毒具有較高的排毒量,這就為使用膠體金檢測該病毒提供了可能,另外,隨著養(yǎng)牛業(yè)的集約化發(fā)展,奶牛和肉牛異地運輸檢疫成為了迫切需要解決的問題之一,臨床上急需一種快速、靈敏、簡便的牛病毒性腹瀉檢測技術(shù),因此,伴隨著膠體金技術(shù)的日益成熟,該方法有望成為最適合現(xiàn)場檢測BVD病毒或抗體的方法,為BVDV的防治提供了有效工具。

童欽等學者在報道中指明[3],現(xiàn)行的檢測BVDV的方法雖然比較多,但它們具有共同的缺點,一是對操作人員有一定的技術(shù)要求;二是需要專門的試劑和儀器[3]。這就限制了這些方法在基層的應(yīng)用,而免疫膠體金試紙條檢測方法在病毒診斷方面具有靈敏度高、速度快、適合現(xiàn)場操作等諸多優(yōu)點,通過研究運用免疫膠體金試紙條法檢測BVDV,將可以有效解決BVDV的現(xiàn)場檢測問題。

目前對我國養(yǎng)牛業(yè)而言,BVDV的重要性及其潛在風險已經(jīng)不言而喻。尤其是經(jīng)過多番風險考驗的奶牛養(yǎng)殖業(yè)正在面臨國內(nèi)外的多重夾擊,對牛群的管理凈化和系統(tǒng)防控需要降低成本并提高效益。本試驗表明,制備的膠體金檢測試紙條與商品化的ELISA檢測試劑盒在靈敏度上無顯著差異,且檢測時間更短,操作更方便,因此可以有效地應(yīng)用于對BVDV感染牛的檢測,結(jié)合分群管理、凈化淘汰等措施,有望做到對本病的凈化,從而提高整體效益。