呂 旭,劉 甜,蒲思斯,劉 琦,李嘉成,毛 飛,邵良庸,陳世昌,王彩云

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古五原縣農(nóng)牧業(yè)局,內(nèi)蒙古 五原 015100)

犬的骨骼標(biāo)本不僅可以生動形象的展現(xiàn)它的骨骼結(jié)構(gòu)和形態(tài),體現(xiàn)犬的不同進(jìn)化狀態(tài),而且可以作為直觀的教具,起到活躍課堂氛圍,增強(qiáng)學(xué)生理解能力的作用[1-2],在實(shí)際教學(xué)過程中起到其他教具不可替代的作用,還可以不受時(shí)間、地點(diǎn)的限制為科研提供方便,對獸醫(yī)診療人員的臨床工作也能起到較大的指導(dǎo)作用,所以骨骼標(biāo)本對教學(xué)、科研和實(shí)踐的作用是其他教具無法替代的。骨骼標(biāo)本制作的步驟主要包括：清除軟組織、脫脂、漂白和串接等,在此過程中能否徹底脫去骨骼中的油脂是制作優(yōu)質(zhì)骨骼標(biāo)本的關(guān)鍵。十二烷基苯磺酸鈉(C18H29NaO3S,簡稱LAS),是一種陰離子表面活性劑,其使用廣泛[3],在制作骨骼標(biāo)本的過程中,我們使用0.02%LAS溶液、3%NaOH溶液、95%酒精(C2H6O)3種不同的試劑對犬骨骼標(biāo)本進(jìn)行了脫脂處理,下面將試驗(yàn)結(jié)果和試驗(yàn)分析做一介紹,為犬骨骼標(biāo)本制作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)器械：解剖剪、解剖刀、脫脂棉、紗布、電磁爐、鐵鍋、電鉆、自制0.5 mm～1.0 mm鉆頭、恒溫箱。

實(shí)驗(yàn)藥品：30%過氧化氫溶液(H2O2)、氫氧化鈉(NaOH)、十二烷基苯磺酸鈉(C18H29NaO3S,簡稱LAS)、95%酒精(C2H6O)。

實(shí)驗(yàn)動物：6歲齡拉布拉多犬1只(體重32 kg),5.5歲齡靈緹犬1只(體重30 kg),6.5歲金毛犬1只(體重35 kg),動物均來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物園。

1.2 方法

1.2.1 動物預(yù)處理 剝皮、摘除內(nèi)臟、剔除肌肉組織：將死亡后的犬仰臥放置于剖解臺上,及時(shí)進(jìn)行剝皮,從腹正中線切開皮膚,逐漸向兩側(cè)分離,在肛門等自然孔及指關(guān)節(jié)末端進(jìn)行環(huán)切。剝離皮膚后打開腹腔,取出全部內(nèi)臟器官后,沖洗軀體上的血漬,放入-20℃冷凍。待實(shí)驗(yàn)條件成熟取出解凍,剔除肌肉組織。在腕骨、籽骨等處剔肉時(shí)要格外小心,防止小的骨骼在處理過程中丟失。肋骨處應(yīng)注意保持軟骨的完整性,避免損傷肋軟骨。先將四肢從軀干分離,然后從頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎將軀干骨分成五部分進(jìn)行后續(xù)處理。頭部處理時(shí)應(yīng)先摘除眼球,將顱腔內(nèi)的大腦用鑷子攪碎后用脫脂棉擦拭取出[4],重復(fù)2～3遍,后用清水沖洗。

1.2.2 煮制脫脂 剔除肌肉后,在長骨的隱蔽處打孔至骨髓腔內(nèi)[5]、小塊骨骼用紗布袋分裝[6],放入鍋中,加水煮沸,隨時(shí)觀察煮制液表面油脂的漂浮情況,記錄不同時(shí)間不同部位的煮制效果,以附著在骨骼上的小塊肌肉及肌腱等是否容易剔除,或自動脫落且不傷害軟骨組織為度[7]。煮制完成后的骨骼繼續(xù)剔除殘留的肌肉肌腱等,然后用清水沖洗2遍,陰干待用。

1.2.3 化學(xué)試劑脫脂 我們將煮制好的拉布拉多犬的骨骼放入0.02%LAS溶液,靈緹犬的骨骼放入95%酒精,金毛犬的骨骼放入3%NaOH溶液進(jìn)行脫脂,記錄相同溫度和時(shí)間下3種脫脂劑對骨骼的脫脂效果。在脫脂后的10、20、30 d和60 d觀察骨骼表面的油漬滲出情況,最后確定最佳脫脂劑,用清水沖洗2遍,陰干待用。

1.2.4 漂白 用毛刷蘸取30%H2O2溶液涂刷脫脂后的骨骼,每隔30 min刷洗1次并觀察效果,依據(jù)不同部位不同骨質(zhì)的骨骼,適當(dāng)增減涂刷次數(shù),以骨骼漂白到理想的效果為度,漂白后的骨骼用清水沖洗2次,自然晾干即可串接固定。

1.2.5 串接固定 將頭部、頸椎、胸椎、腰椎、薦椎、尾椎和四肢依次打孔串接[5、13],肋骨與胸椎,胸骨與肋骨串接,指骨、籽骨等不能打孔的小骨骼用膠水粘接牢固。串接固定前先確定好骨骼之間的角度,避免串接后姿態(tài)異常影響美觀。串接完畢后,擺好標(biāo)本的姿態(tài),用支架將骨骼標(biāo)本固定于底座上,蓋上防塵罩。

2 結(jié)果

2.1 自來水煮制試驗(yàn)結(jié)果 將3只犬分別放入盛有自來水的鍋中煮制,根據(jù)不同部位的骨骼一般需要1 h～3.5 h不等,本次試驗(yàn)根據(jù)煮制過程中骨骼的骨塊完整程度、殘肉粘附度等為具體指標(biāo)進(jìn)行評價(jià),結(jié)果見表1。

表1 犬骨骼煮制脫脂試驗(yàn)結(jié)果

由表1看出,不同部位骨骼煮制效果最佳的時(shí)間為：頸椎、胸椎、腰椎3.0 h;肋骨、尾椎2.5 h～3.0 h;掌骨、指骨、趾骨等小骨骼煮制2.5 h;四肢骨、骨盆腔和頭骨2 h～3 h;胸骨和劍狀軟骨1.5 h。經(jīng)觀察,在暗處打孔的長骨在煮制1 h左右就有大量油脂漂浮于煮制液表面,對骨髓腔內(nèi)脫脂起到了一定的效果。

2.2 化學(xué)試劑脫脂試驗(yàn)結(jié)果 在25℃ ～30℃室溫下,將煮制好的拉布拉多犬的骨骼放入0.02%LAS溶液(A組),靈緹犬的骨骼放入95%酒精(B組),金毛犬的骨骼放入3%NaOH溶液(C組)進(jìn)行脫脂,不同時(shí)間點(diǎn)的脫脂結(jié)果見表2,犬骨骼脫脂后保存結(jié)果見表3。

表2 犬骨骼化學(xué)試劑脫脂試驗(yàn)結(jié)果

表3 犬骨骼脫脂后保存結(jié)果

根據(jù)表2和表3結(jié)果綜合分析得出,LAS在48 h脫脂即可達(dá)到理想的效果,且在保存30 d內(nèi)無油脂滲出,而95%C2H6O脫脂48 h未達(dá)到脫脂目的,3%NaOH溶液在48 h雖然達(dá)到了脫脂目的,但對骨骼有了一定程度的損壞。

3 討論

3.1 犬骨骼標(biāo)本制作個(gè)體的選擇 在制作骨骼標(biāo)本的過程中,犬個(gè)體的體重和骨質(zhì)的堅(jiān)硬程度決定了骨骼標(biāo)本的質(zhì)量,因此,對個(gè)體的選擇非常關(guān)鍵。對于犬,如果年齡太小[8],骨塊沒有完全愈合,骨連接處軟骨較多,在煮制、脫脂、漂白過程中易脫落且很難拼接,制作完成后的骨骼標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)不明顯,標(biāo)本失去研究價(jià)值;若年齡過大,骨質(zhì)疏松,在制作過程中及日后的保存容易被損壞。體重應(yīng)選擇中等偏瘦的犬,偏胖的犬脂肪較多,脫脂較困難,如果太瘦,骨骼的整體形態(tài)突顯較差。因此應(yīng)選擇5～7歲齡且中等偏瘦的犬,此年齡段的犬骨塊完全愈合,骨末端的軟骨較結(jié)實(shí),且骨質(zhì)堅(jiān)硬,最適合制作骨骼標(biāo)本。

3.2 自來水煮制脫脂試驗(yàn) 實(shí)踐證明,較難剔除的組織若強(qiáng)力剔除,會損壞骨面,經(jīng)過煮制后,這些組織會緊縮或者自然脫落,易于剝離。同時(shí),煮制的過程中也會起到一定的脫脂作用。長骨在隱蔽處打孔[5、13]后,脫脂效果更佳,在煮制1 h左右就會有大量油脂滲出,同時(shí)此步驟減少了化學(xué)試劑脫脂的時(shí)間。另外,根據(jù)骨塊的大小和骨骼的結(jié)構(gòu),不同部位骨骼的煮制時(shí)間也各有不同,胸骨、劍狀軟骨等煮制1 h左右即可,時(shí)間不可過長,否則會變形變脆影響骨骼的正常形態(tài);椎骨和長骨體積較大,且椎骨結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,長時(shí)間煮制后,附著組織基本會自然脫離,一般煮制3 h～3.5 h,有利于后期的處理;小骨骼及肋骨應(yīng)分裝后煮制,如四肢應(yīng)分別裝袋[6]后煮制,這樣既會避免骨骼丟失,也會方便后期處理。

3.3 化學(xué)試劑脫脂試驗(yàn) 經(jīng)過長期的實(shí)踐,傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑脫脂[9]效果雖好,但缺點(diǎn)較多,如二甲苯刺激性大、劇毒,汽油、酒精等易燃易爆,安全性較低,近年應(yīng)用于骨骼標(biāo)本制作的香蕉水脫脂[10]成本相對較高,NaOH溶液又有腐蝕性,脫脂過程中對骨骼易產(chǎn)生損害,且需要不斷觀察,掌握不好脫脂濃度和時(shí)間就會對骨骼標(biāo)本造成不可挽回的損害。經(jīng)過長期試驗(yàn),我們認(rèn)為LAS廉價(jià)高效、低毒環(huán)保、不易氧化,是一種優(yōu)良的骨骼標(biāo)本脫脂劑,LAS與酒精、氫氧化鈉在相同溫度相同時(shí)間下進(jìn)行對比試驗(yàn)的結(jié)果證明,LAS在犬的骨骼標(biāo)本制作中可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)溶劑或氫氧化鈉進(jìn)行脫脂。

LAS是一種陰離子表面活性物質(zhì),對水的硬度較敏感,在硬度低的水中活性高,脫脂能力較強(qiáng),用蒸餾水配制后效果較好,強(qiáng)于用自來水配制的溶液,生物降解度＞90%[11]。目前常作為洗調(diào)劑、金屬脫脂劑、樹脂分散劑等許多方面的單獨(dú)成分或配合成分,其具有去污、脫脂、乳化、分散等性能。LAS應(yīng)用于骨骼標(biāo)本脫脂的優(yōu)點(diǎn)：(1)易于購買,相對于有機(jī)溶劑和NaOH溶液來說更為安全環(huán)保,成本更低;(2)溶于蒸餾水后液體清亮,脫脂過程中會變的越來越渾濁,所以可根據(jù)液體的渾濁程度來判斷脫脂情況;(3)脫脂的速度快,對于犬的骨骼來說,在25℃～30℃下0.02%的LAS溶液僅需48 h左右便可完成整個(gè)脫脂過程,且在后期保存過程中沒有油脂滲出的情況。在試驗(yàn)過程中,根據(jù)骨骼體積的不同,脫脂時(shí)間也可適當(dāng)增加或縮減。但LAS對皮膚有輕度刺激性[12],長時(shí)間接觸后會有輕微皮膚干燥、皸裂等,操作時(shí)戴橡膠手套、口罩、穿工作服即可。