牛 康,徐 璐,張乾義,夏應菊,朱元源,鄒興啟,李 翠,趙啟祖,王 琴

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家/OIE豬瘟參考實驗室,北京 海淀 100081)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的對世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失的一種高度傳染性疾病,是OIE規(guī)定必須上報的疫病[1]。CSFV是單股正鏈RNA病毒,其基因組的大小為12.3 kb,含有單個大型開放閱讀框編碼約3 898個氨基酸的多聚蛋白,其經(jīng)過宿主細胞及病毒酶的加工形成結(jié)構(gòu)蛋白(C,Erns,E1和E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B)[2]。Erns蛋白的分子量大小為44～48 kDa[3],其潛在的糖基化位點有9個,Erns蛋白的糖基化反應能夠影響免疫應答,Erns蛋白的中和表位也依賴于糖基化的存在[4]。糖基化過程會影響Erns蛋白的分泌和其二聚體的合成與加工,這種糖基化模式能夠影響病毒的毒力,在病毒的吸附、進入、釋放過程中起到重要作用[5]。Erns蛋白參與CSFV的吸附和自噬的調(diào)控[6-7],能夠抑制I型干擾素的合成[8-9],從而引起持續(xù)性感染[10]。Erns蛋白和E2蛋白可刺激機體產(chǎn)生中和抗體并提供保護作用[11-12]。因此,豬瘟的血清學診斷主要針對Erns蛋白和E2蛋白[13]。囊膜糖蛋白E2是主要的抗原蛋白,目前已有E2蛋白的亞單位疫苗問世。另外,以E2基因為目標的能夠區(qū)分感染和免疫動物(Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA)的標記疫苗也是當前的研究熱點。因此,Erns蛋白就成了開發(fā)相應的鑒別檢測方法的首選蛋白[14-15]。本研究擬利用桿狀病毒系統(tǒng)表達并純化Erns蛋白,并驗證純化后Erns蛋白的反應原性,為研究亞單位疫苗和DIVA疫苗的鑒別診斷試劑盒以及Erns蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學功能奠定重要基礎(chǔ)。目前應用于蛋白表達的系統(tǒng)多為原核表達系統(tǒng),表達產(chǎn)物多以包涵體形式存在[16],而真核表達系統(tǒng)(如酵母和昆蟲細胞)克服了此缺點。Luo Y等[17]在酵母表達系統(tǒng)中獲得了具有生物活性的Erns蛋白。Liu chen等[16]在桿狀病毒系統(tǒng)中成功表達Erns蛋白,并證實Erns蛋白具有RNA酶活性,這表明通過桿狀病毒系統(tǒng)表達的Erns蛋白與天然結(jié)構(gòu)的Erns蛋白是相似的。本研究利用桿狀病毒系統(tǒng)表達豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Erns,并對其反應原性進行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建表達豬瘟病毒Erns蛋白的重組桿狀病毒,通過對表達和純化條件的優(yōu)化得到可溶性的高效表達的Erns蛋白,并對其特性進行鑒定,為CSFV的感染、復制、致病機理等方面的研究以及DIVA疫苗的開發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒、質(zhì)粒、細胞和相關(guān)試劑：SM株(CVCC AV1411)由本實驗室保存;TaKaRa病毒RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq酶等,購自寶生物工程(大連)有限公司;限制性內(nèi)切酶 BamH I、Xba I,購自NEB公司;T4DNA連接酶,購自Promega公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒Ⅱ,購自O(shè)mega公司;DH5α感受態(tài)細胞,購自天根生化科技(北京)有限公司;Bluo-Gal,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Cellfection Ⅱ Reagent、Grace's insect medium 1x,unsupplemented、Sf900Ⅱ SFM,購自Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)、馬血清,購自GIBCO公司;FITC標記的羊抗鼠抗體、抗His標簽的單抗、兔抗豬二抗,購自Sigma公司;Ripa(中)裂解液、Pmsf,購自碧云天生物公司。轉(zhuǎn)移表達載體 pFastBac HT A、DH10Bac感受態(tài)細胞、Sf9細胞、豬瘟病毒陽性血清、Erns單抗由本實驗室保存。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GeneBank(AF333000)SM株 Erns基因序列設(shè)計引物,上游引物：5′-CGC GGATCC G GAAAATATAACTCAAT-3′(斜體為 Bam-HI酶切位點)、下游引物：5′-GC TCTAGA TT ACAGTAAGGCGATAGGG-3′(斜體為 XbaI酶切位點),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 Erns基因的擴增和重組轉(zhuǎn)移載體pFastbac HT A-Erns的構(gòu)建 參照TaKaRa病毒RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA,并進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 PCR 反應體系為：Erns-F、Erns-R 各1.5 μL;Ex Taq 酶 12.5 μL;cDNA 5 μL;ddH2O 4.5 μL。 反應程序如下：97℃預變性1 min;98℃變性10 s;52℃退火30 s;72℃延伸1 min,共35次循環(huán);72℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,出現(xiàn)了一條分子量約為700 bp的目的條帶(圖1),與預期大小(696 bp)相符。

使用BamH I和Xba I對回收的目的基因雙酶切并克隆至表達載體pFastbac HT A,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中,挑取單菌落過夜培養(yǎng)并提質(zhì)粒,進行PCR、雙酶切鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可見大小為4 856 bp左右的載體片段和696 bp左右的Erns基因片段(圖1)。將陽性質(zhì)粒進行測序,將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pFA-Erns。

圖1 Erns基因的RT-PCR擴增與pFastbac HT A-Erns的雙酶切鑒定

1.2.3 重組桿粒rBacmid-Erns的構(gòu)建 將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10bac感受態(tài)細胞中,經(jīng)藍白斑篩選及二次篩選后挑取單個白色大菌落進行培養(yǎng),提取桿粒,利用M13-F和M13-R通用引物對桿粒進行PCR鑒定,得到片段大小為3 126 bp(圖2),并將PCR產(chǎn)物送測序。將鑒定正確的重組桿粒命名為rBacmid-Erns。

圖2 重組桿粒rBacmid-Erns的PCR鑒定

1.2.4 收獲重組桿狀病毒 將重組桿粒rBacmid-Erns轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的sf9細胞中,在27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),轉(zhuǎn)染后4 d收取sf9細胞培養(yǎng)上清,即為P1代重組桿狀病毒,命名為rBac-Erns,繼續(xù)將P1代毒接種于對數(shù)生長期的sf9細胞中盲傳至第3代獲得P3代病毒并置于-80℃避光保存。

1.2.5 Erns蛋白的表達及Western Blot鑒定 將P3代重組桿狀病毒及野生桿狀病毒感染sf9細胞72 h后,棄去細胞培養(yǎng)上清,使用PBS沖洗細胞,2 000 r/min離心5 min,棄上清。向細胞沉淀中加入ripa裂解液裂解10 min后,12 000 r/min(4℃)離心取上清。加入5×Loading Buffer,煮沸10 min,取10 μL樣品進行SDS-PAGE電泳。

結(jié)果表明,在37 kD左右出現(xiàn)條帶,與目的大小相符(圖3A),對照細胞無此條帶。

SDS-PAGE電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,分別用1∶300稀釋的豬瘟陽性血清及1∶300稀釋的His單抗作為一抗,以兔抗豬二抗(1∶2 000稀釋)和羊抗鼠二抗(1∶2 000稀釋)作為二抗對表達產(chǎn)物進行Western-Blotting分析。

Western-Blotting結(jié)果表明,豬瘟陽性血清(圖3B)和His單抗(圖3C)都可以與目的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合;對照細胞裂解上清均沒有目的蛋白與高免血清和His單抗發(fā)生特異性結(jié)合。

1.2.6 間接免疫熒光法鑒定Erns重組蛋白的表達

在96孔板鋪好sf9昆蟲細胞,細胞密度為70% ～80%。將P3代桿狀病毒稀釋103倍并接種sf9細胞,每孔加100 μL。在27℃細胞培養(yǎng)箱中吸附1 h后每孔補加維持液100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)72 h。使用4%甲醛室溫固定30 min,棄固定液,用PBS洗2～3次,再加0.1%triton X-100室溫靜置15～20 min,棄triton X-100,用PBS洗2次,分別使用50 μL 5%BSA稀釋的Erns單抗和His單抗37℃孵育1 h,吸棄一抗,PBS洗2～3次。每孔加5%BSA稀釋的二抗50 μL,37℃孵育1 h,吸棄二抗,PBS洗2～3次。在熒光顯微鏡下觀察重組蛋白Erns的表達情況。

經(jīng)P3代重組病毒感染的sf9昆蟲細胞的胞漿中有亮綠色的熒光(中插彩版圖4-A、圖5-A),而未接毒的sf9細胞對照呈陰性(中插彩版圖4-B、中插彩版圖5-B),說明Erns基因和His標簽成功表達。

1.2.7 Erns蛋白表達條件的優(yōu)化 使用P3代重組病毒接種對數(shù)生長期的sf9細胞,分別在48 h、60 h、72 h、84 h、96 h收樣,檢測蛋白的表達量,再以不同的感染復數(shù)(MOI=0.1、0.5、1、2、5、10)分別接毒收樣,檢測Erns蛋白的表達量。

結(jié)果表明,在MOI=1,表達時間為72 h,蛋白的表達量最高(圖6)。

1.2.8 Erns蛋白的純化 按照優(yōu)化好的表達條件大量表達Erns蛋白,使用HIS標簽親和層析法純化Erns蛋白,并對純化后的蛋白進行SDS-PAGE檢測,獲得了單一條帶的目的蛋白(圖7)。使用BCA法測定蛋白的濃度為0.2 mg/mL。

1.2.9 純化后Erns蛋白的Western Blotting鑒定使用Erns單克隆抗體對純化后的Erns蛋白進行Western Blotting鑒定,結(jié)果證明,純化后的Erns蛋白具有很好的反應性(圖7)。

圖3 Erns基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western-Blotting鑒定

圖6 不同收獲時間及不同MOI對Erns蛋白表達量的影響

圖7 純化后的Erns蛋白的SDS-PAGE分析

1.2.10 豬瘟陽性血清的檢測 將純化后的Erns蛋白采用適宜濃度進行包被,并對3份豬瘟陽性血清和3份陰性血清進行檢測,平均P/N值為4.74,說明采用Erns蛋白建立的間接 ELISA方法能夠有效的區(qū)分豬瘟陽性血清和陰性血清(圖9)。

圖8 純化后Erns蛋白的Western Blotting鑒定

2 討論

圖9 豬瘟陽性血清與Erns蛋白表達抗原的ELISA反應結(jié)果

豬瘟對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害,根據(jù)《國家豬瘟防治指導意見(2017-2020年)》,2020年底,全國所有種豬場和部分區(qū)域要達到豬瘟凈化標準。傳統(tǒng)的疫苗雖能有效防控豬瘟但不具備能夠鑒別自然感染與疫苗免疫的功能,因此需要開發(fā)新型DIVA疫苗和與之相應配套的檢測Erns抗體的ELISA方法,以促進豬瘟的凈化和最終根除。CSFV的E2蛋白是豬瘟病毒的主要保護性抗原蛋白,參與豬瘟病毒感染過程并誘導機體產(chǎn)生中和抗體,也是DIVA疫苗研究的重要靶蛋白。Erns蛋白也能刺激機體產(chǎn)生中和抗體,因此是鑒別診斷豬瘟野毒感染與疫苗免疫的靶抗原。而NS3蛋白在所有的豬瘟病毒屬病毒中相對保守,其刺激機體產(chǎn)生的抗體會與其他屬的病毒發(fā)生交叉反應,因此不能作為鑒別診斷的理想抗原。

糖基化反應是蛋白質(zhì)修飾的最普遍的類型之一。CSFV的Erns蛋白包括7個糖基化位點,分別在2、7、11、65、95、143,158 位。 病毒蛋白的糖基化會影響免疫反應的產(chǎn)生及蛋白的天然構(gòu)象,所以得到正確糖基化的Erns蛋白對于CSFV診斷方法的建立以及新型標記疫苗的研發(fā)具有重要意義[18]。由于真核表達系統(tǒng)具有翻譯后的修飾作用,因此更容易獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物。本試驗選擇桿狀病毒表達系統(tǒng),該系統(tǒng)具有表達產(chǎn)物產(chǎn)量高、生物活性好、產(chǎn)物接近天然構(gòu)象等優(yōu)勢[19-20]。使用 Erns單抗進行Western Blotting鑒定,目的蛋白的大小約為37 kD,這比非糖基化的Erns蛋白分子量(約25 kD)大,結(jié)果證明,獲得的重組Erns蛋白發(fā)生了糖基化。

在本試驗采用親和層析技術(shù)對Erns蛋白進行純化。純化開始前,先使用超濾管對收集的含有目的蛋白的細胞裂解上清液進行濃縮。目的蛋白帶有6×His標簽,其與特定配基結(jié)合使得雜蛋白流過柱子,達到分離純化的效果。而且6×His標簽的大小可以忽略不計且不具備免疫源性,純化后的蛋白可以直接免疫動物[21]。但是單一使用親和層析的方法進行純化的效果不是最好,會得到一些非目的蛋白,將多種純化方法進行排列組合可能會取得更好的效果。有研究表明,蛋白純化投入的成本能占到整個基因工程產(chǎn)品的70%左右[22],因此蛋白純化技術(shù)會是未來醫(yī)藥研發(fā)的突破口。

本研究成功利用桿狀病毒系統(tǒng)實現(xiàn)豬瘟病毒Erns蛋白的高效表達,并通過親和層析技術(shù)得到了純度良好、具有生物活性的純化的Erns蛋白。經(jīng)Western Blotting鑒定,純化后的Erns蛋白具有良好的反應原性,為今后進一步建立與DIVA疫苗相配套的檢測Erns抗體的ELISA方法奠定了基礎(chǔ);也為Erns蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學功能研究奠定了重要基礎(chǔ)。