殷龍飛 王朝陽 吳忠義 張中保,* 于 榮,*

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玉米基因的克隆及功能研究

殷龍飛1,2王朝陽1吳忠義2張中保2,*于 榮1,*

1首都師范大學生命科學學院, 北京 100048;2北京市農林科學院農業(yè)生物技術研究中心/ 北京市農業(yè)基因資源和生物技術重點實驗室, 北京 100097

GRAS蛋白家族是一類植物特有的轉錄調控因子, 在多種植物中均有報道。為了探究玉米基因家族在逆境脅迫下的功能, 本研究從玉米根中克隆獲得(AC: NC_024462), 該基因全長1422 bp, 編碼473個氨基酸。生物信息學分析表明ZmGRAS31蛋白分子量為51,700.38 Da, 理論等電點為4.73, 具有GRAS轉錄因子家族特有的保守結構域, 但不具跨膜結構, 親水性較差。玉米原生質體瞬時表達實驗表明ZmGRAS31定位于細胞核內。實時熒光定量PCR (qPCR)分析表明, 在低溫、脫水、高鹽、干旱處理下,在玉米幼苗均上調表達; 不同濃度NaCl處理過表達轉基因擬南芥植株, 其根長優(yōu)于野生型, 由此推測該基因可能參與玉米非生物脅迫應答。

玉米;; 轉錄因子; 原生質體; qPCR; 非生物脅迫

玉米(L.)不僅是重要的糧食和飼料作物, 也是重要的食品工業(yè)原料和能源植物[1]。玉米起源于南美洲高溫多濕的熱帶地區(qū), 喜高溫、需水較多、耐旱性不強, 對鹽脅迫中度敏感, 耐鹽性較差[2]。土壤干旱、鹽堿化嚴重影響玉米產量, 隨著生態(tài)環(huán)境的破壞, 如何提高玉米對干旱、高鹽等不利因素的抵抗能力越來越受到重視。

轉錄因子(transcription factor, TF)又稱為反式作用因子, 在真核生物細胞中能夠結合到靶基因啟動子區(qū)域激活或抑制其轉錄表達, 從而實現(xiàn)對靶基因的轉錄調控[3]。近年來, 研究人員陸續(xù)從高等植物體內分離出一些與干旱、高鹽堿、低溫脅迫以及激素和生長發(fā)育相關的轉錄因子; 主要可分為MYB (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)[4-6]、Bzip (Basicreg ion/leuci nezipper)[7-9]、CBF/DREB (C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding protein)[10-12]、NAC (NAM, ATAF1/2, CUC1/2)[13-15]、WRKY[16-17]、HD-START (homeodomain-StAR-related lipid transfer)[18]、GRAS (GAI, RGA, SCR)[19-20]等幾大類。轉錄因子通過調控下游逆境應答相關基因的表達從而改善植物非生物脅迫抵抗能力; 因此, 轉錄因子在抗逆研究中起非常重要的作用。

GRAS家族是近年來在高等植物體內發(fā)現(xiàn)的一類轉錄因子, 廣泛存在于植物體內。典型的GRAS蛋白由400~700個氨基酸組成, 高度保守的羧基端含有核心基序VHIID, 存在于所有家族成員中。模式植物擬南芥和水稻GRAS家族成員可分為8個亞族即SCL3 (scarecrow-like 3)、LISCL (SCL9被重命名為LISCL)、SHR (short-root)、PAT1 (phytochrome a signal transduction 1)、DELLA、SCR (scarecrow)、LS (lateral suppressor)和HAM (hairy meristem)[20]。GRAS家族成員功能多樣, 調控許多重要的生長發(fā)育過程。植物轉錄因子的研究熱點主要集中在抗逆脅迫、信號轉導、生長發(fā)育、根瘤和菌根的形成等方面。其中, HAM亞家族主要維持莖尖分生組織處于未分化狀態(tài); 在矮牽牛突變體中, 莖尖分生組織不能保持其未分化的特征[21]。非細胞自主性(non-cell-autonomously)功能來源于側向器官原基(lateral organ primordial)和莖原維管組織(stem provascular tissue)的L3細胞, 該功能對莖尖分生組織的維持非常重要[22]。但是, 關于HAM亞家族基因在玉米逆境脅迫應答中所起的作用還未見報道, 本研究克隆了玉米HAM亞家族成員基因, 研究了該基因的表達模式、亞細胞定位和在高鹽、脫水、低溫、干旱等脅迫處理下的表達情況; 以及鹽、甘露醇處理下對過表達該基因擬南芥根長的影響, 旨在深入了解GRAS蛋白家族的生理功能, 為農作物抵御干旱, 增加產量提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

溫室中種植玉米骨干自交系B73, 生長到三葉一心時期進行不同逆境處理; 黑暗條件下種植玉米骨干自交系鄭58, 取黃化苗胚芽鞘提取原生質體進行基因亞細胞定位。農桿菌GV3101為本實驗室保存, 大腸桿菌Trans1T1(貨號M2650817)、pEASY T5Zero Clone載體(貨號M20801)、RNA提取試劑盒(貨號M30902)、逆轉錄試劑盒(M30919)等均購于北京全式金生物技術有限公司, Ex(貨號AI12716A)、LA(貨號AI10495A)、SYBRPremix ExII (Tli RNaseH Plus)(AI40782A)等購于寶生物工程(大連)有限公司,I (貨號R0191L)、I (貨號R0552L)內切酶購于NEB (北京)公司,R I (1040B)、I (1068B)內切酶購于寶生物工程(大連)有限公司; 低溫臺式離心機(型號MUITLFUGE X1R)購于賽默飛公司, 低溫臺式水平離心機(型號SC-3612)購于中佳公司; PCR儀(型號T100 Thermal Cycler)購于伯樂公司; 應用Image J統(tǒng)計分析擬南芥根長。

1.2 玉米總RNA的提取及ZmGRAS31 cDNA的克隆

按照全式金Transzol Up Plus RNA Kit試劑盒的說明提取玉米根組織的總RNA, 逆轉錄得到cDNA模板。設計引物pZmGRAS31-F、pZmGRAS31-R, 以逆轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增, 反應程序為94°C預變性60 s; 98°C 10 s, 68°C 120 s, 30個循環(huán); 72°C 延伸10 min, 獲得全長。PCR產物經膠回收后連接至T5Zero載體, 獲得單克隆后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行菌落測序。各引物序列見表1。

表1 本實驗中所用的引物

1.3 玉米ZmGRAS31基因的亞細胞定位

1.3.1 植物表達載體pYBA1132:ZmGRAS31:EGFP的構建 使用引物pZmGRAS31SL-F、pZmGRAS31SL-R擴增獲得基因含有酶切位點的編碼區(qū), PCR產物經R I、I雙酶切連接至PYBA1132表達載體上獲得重組載體。將重組載體轉化大腸桿菌(Trans1T1)后, 挑取陽性克隆測序驗證。

1.3.2 玉米原生質體的提取及轉化 以玉米自交系鄭58黃化苗胚芽鞘為材料, 依據(jù)Yoo的方法[23]提取原生質體并轉化。配制母液: 0.8 mol L–1甘露醇、0.2 mol L–1MES-KOH (pH 5.7)、1 mol L–1KCl、1 mol L–1CaCl2、1 mol L–1NaCl、1 mol L–1MgCl2、0.1 mg mL–1BAS。使用新鮮酶溶液及PEG-Ca2+(40%, v/v)溶液, WI (0.5 mol L–1甘露醇、4 mol L–1MES-KOH、20 mmol L–1KCl )、W5 (154 mmol L–1NaCl、125 mol L–1CaCl2、5 mmol L–1KCl、2 mmol L–1MES, pH 5.7)、MMG (0.4 mol L–1甘露醇、4 mmol L–1MES, pH 5.7)溶液均由母液與ddH2O按說明配制。轉化后的原生質體室溫黑暗孵育16 h加入0.1% Tween 20, 輕輕混勻后再加入終濃度為5 μmol L–1的DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindole)染色5 min, 經PBS緩沖液洗滌后于激光共聚焦顯微鏡(zeiss 780)下觀看熒光情況。

1.4 玉米ZmGRAS31基因的抗逆表達及組織差異表達——qPCR分析

挑選飽滿的自交系B73種子種植于溫室花盆中, 分別設置對照組、脫水處理組、鹽(200 mmol L–1NaCl)處理組、冷(4℃)處理組、干旱處理組, 每組6盆, 每盆2顆, 各設3個生物學重復。玉米幼苗正常生長至三葉一心時期分別進行脫水、高鹽、冷、干旱處理, 取脫水、高鹽、冷處理0 h、1 h、2 h、5 h、10 h、24 h后的地上部和根, ?80℃凍存。干旱組取處理0 d、3 d、7 d、12 d后的地上部和根, ?80℃凍存。取組織差異表達材料幼苗的根、葉以及抽雄期的根、莖、葉、雄穗、花絲、幼胚, ?80℃凍存。

按照試劑盒的說明提取地上部及根RNA, 逆轉錄后作為qPCR模板。設計特異引物pZmGRAS31RT- F、pZmGRAS31RT-R及內參基因特異引物pGAPDHRT-F、pGAPDHRT-R。應用ABI Step One Plus Real-time PCR System進行實時熒光擴增。反應體系10 μL 2×SYBR Premix Ex、0.4 μL GSP (10 μmol L–1)、1 μL cDNA模板、0.4 μL ROX、7.8 μL ddH2O。PCR條件為95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 共40個循環(huán); 融解曲線分析的Step 1: 95℃ 15 s; Step 2: 60℃ 1 min; Step 3: 95℃ 15 s。每組實驗設3個生物學樣本, 每個生物學樣本設3個技術重復, 數(shù)據(jù)為3個生物學重復平均值±標準誤。應用2–??CT方法分析在各組織中的相對表達情況[24]。逆境處理實驗分別以0 h幼苗的根和地上部中的表達量計為1, 組織差異表達實驗中以抽雄期的根組織中的表達量計為1。

1.5 植物過表達載體p4301:ZmGRAS31的構建及擬南芥遺傳轉化

1.5.1 過表達載體構建 設計引物pZmGRAS31At-F、pZmGRAS31At-R擴增的編碼區(qū)片段。PCR產物經I、I酶切消化后連接到TOPO載體上, 產物轉化大腸桿菌Trans110 (非甲基化), 經含有壯觀霉素抗性固體培養(yǎng)基篩選后, 挑取陽性克隆進行菌體PCR檢驗及酶切驗證, 并送測序。

1.5.2 Gateway目的載體(Destination Vector)的構建

按Invitrogen Gateway LR Clonase II Enzyme Mix試劑盒說明, 將TOPO載體上目的基因轉移到含有att R1、att R2重組位點的pCAMBIA4301載體上, 構建pCAMBIA4301:ZmGRAS31重組質粒。

1.5.3 轉化農桿菌GV3101及侵染擬南芥 將pCAMBIA4301:ZmGRAS31重組質粒轉入農桿菌GV3101, 篩選鑒定后通過浸花法侵染擬南芥[25]。單株收取T0代種子, 經卡那霉素抗性篩選后獲得T1代轉基因擬南芥。提取T1代幼苗葉片基因組DNA為模板進行PCR檢測, 擴增引物為pZmGRAS31-F、pZmGRAS31-R, 產物連到T載體后送測序驗證。單株收獲陽性植株種子并加代獲得T3代純合植株。

1.5.4 轉基因擬南芥種子逆境處理 利用含NaCl、甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基對轉基因擬南芥分別模擬鹽、干旱脅迫。配制梯度濃度的1/2 MS培養(yǎng)基。NaCl濃度梯度為0 mol L–1、0.1 mol L–1、0.15 mol L–1、0.20 mol L–1, 甘露醇濃度梯度為0 mol L–1、0.15 mol L–1、0.30 mmol L–1、0.45 mol L–1, 調pH 5.8。將1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長7 d的轉基因和野生型擬南芥幼苗(根長相同), 分別移栽到含不同濃度NaCl、甘露醇的1/2 MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分為兩部分, 野生型和轉基因擬南芥各移3株, 設3個重復, 垂直放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 7 d后統(tǒng)計根長, 重復3次實驗。

2 結果與分析

2.1 玉米轉錄因子ZmGRAS31基因序列擴增

基因編碼序列全長1422 bp, 編碼473個氨基酸。通過保守結構域分析發(fā)現(xiàn), ZmGRAS31蛋白包含GRAS保守結構域(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)(圖1)。生物信息學分析表明該蛋白分子量為51,700.38 Da, 理論等電點為4.73; 不具跨膜結構, 親水性較差, ZmGRAS31蛋白二級結構以α螺旋為主(50.32%)。

2.2 玉米原生質體中的亞細胞定位

構建瞬時表達載體pYBA1132:ZmGRAS31: EGFP并轉化玉米原生質體, 通過(Enhanced green fluorescent protein)融合蛋白的熒光顯示目的蛋白的亞細胞定位。原生質體經DAPI染色后于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 帶有目的基因的GFP融合蛋白綠色熒光只分布在細胞核, 并且與核特異染料DAPI的藍色熒光完全重合(圖2), 表明ZmGRAS31是一個核蛋白。

2.3 玉米ZmGRAS31基因在不同組織中的表達情況

分別提取幼苗的根、葉及抽雄期的根、莖、葉、雄穗、花絲、幼胚組織總RNA, 逆轉錄獲得cDNA后進行qPCR分析表明,在不同組織中表達差異較大, 以抽雄期根中的表達量為標準進行比較, 幼根中的表達量最高, 約為成熟根中表達量的17.7倍; 其次是雄穗表達量約為1.6倍; 其他組織的表達量均低于成熟根中, 花絲中的表達量最低(圖3)。由此推測可能在幼根生長及雄配子形成過程中發(fā)揮重要作用。

圖1 玉米ZmGRAS31基因保守結構域預測

圖2 玉米ZmGRAS31蛋白在原生質體中的亞細胞定位

GFP: GFP標記的1基因在玉米原生質體的亞細胞定位; DAPI: DAPI標記的原生質體細胞核; Bright: 同一視野光鏡下的原生質體; Merged: 光鏡及熒光照片的疊加; CK: 轉入空載體的原生質體;: 轉入目的載體的原生質體。Bar=10 μm。

GFP: subcellular localization of the GFP-ZmGRAS31 fusion protein in maize protoplast; DAPI: DAPI-labeled protoplast nucleus; Bright: protoplast under the same field; Merged: merge of GFP, DAPI, and bright; CK: protoplast with empty vector;: protoplast with destination vector. Bar=10 μm.

圖3 ZmGRAS31在玉米不同組織中的相對表達量

2.4 不同逆境處理對玉米幼苗ZmGRAS31基因表達的影響

應用2–??CT方法分析各處理下的表達情況。脫水處理下, 地上部的表達量在5 h內逐漸上調達到峰值, 約為對照的18.7倍, 至24 h表達量約為對照的2.4倍; 根中的表達量也是逐步上調并在5 h時到達峰值, 約為對照的7.5倍, 到24 h時約下調至對照水平(0.78倍)(圖4-A)。低溫處理下, 如圖4-B所示, 地上部的表達量先上調然后回落隨后又上調, 并在5 h時達到峰值, 約為對照的6.6倍; 5 h后下調明顯, 至24 h時約為對照的0.3倍; 根中迅速上調至對照4.0倍左右并維持到5 h, 到24 h時下調至對照0.2倍左右。鹽處理下, 地上部迅速上調, 1 h時達到峰值, 約為對照2.5倍, 隨后下調至對照0.5倍左右。根中逐漸上調并在5 h時達到峰值, 約為對照1.8倍, 到24 h時下調至對照0.45倍左右(圖4-C)。干旱處理下, 地上部分在3 d內呈上調趨勢, 3 d時達到峰值, 約為對照11倍, 隨后下調至12 d時,的表達量約為對照2.5倍; 根中也是在3 d時達到峰值, 約為對照16倍, 隨后下調, 至12 d時約為對照0.5倍(圖4-D)。

圖4 實時熒光定量PCR分析不同處理條件下ZmGRAS31基因在地上部和根中的表達情況

A: 脫水處理; B: 低溫(4°C)處理; C: 高鹽(200 mmol L–1NaCl); D: 干旱處理。數(shù)據(jù)為3個生物學重復±標準差。

A: dehydration treatment; B: cold (4°C) treatment; C: high salt (200 mmol L–1NaCl) treatment; D: drought treatment. The error bar represents ± SD of triplicate experiments.

2.5 轉ZmGRAS31基因擬南芥的耐鹽性分析

提取具卡那霉素抗性轉基因擬南芥葉片DNA進行PCR檢測, 鑒定有5株轉基因擬南芥含有目的基因, qPCR檢測轉基因擬南芥株系中基因的表達水平, 選取表達量最高的兩株系進行轉基因擬南芥耐鹽、耐甘露醇實驗(結果未展示)。0 mol L–1NaCl濃度時野生型和轉基因擬南芥均能正常生長(圖5-A), 當NaCl濃度為0.10 mol L–1時, 野生型和轉基因擬南芥均能正常生長, 轉基因擬南芥主根比野生型長, 差異顯著(<0.05)(圖5-B)。當NaCl濃度為0.15 mol L–1時, 野生型和轉基因擬南芥均不能正常生長, 整體表現(xiàn)為株型偏小, 葉片發(fā)黃, 無或很少側根但轉基因擬南芥的主根比野生型長, 差異顯著(<0.05)(圖5-C)。當NaCl濃度升為0.20 mol L–1時, 野生型和轉基因擬南芥均不能正常生長, 葉片發(fā)黃枯死, 主根不生長, 無側根(圖5-D)。統(tǒng)計分析野生型和轉基因擬南芥根長(圖5-E)。

圖5 不同鹽濃度下轉基因擬南芥根長比較

A~D分別為0 mol L–1、0.10 mol L–1、0.15 mol L–1、0.20 mol L–1NaCl處理的生長情況; E: 不同鹽濃度下擬南芥平均主根長度; WT: 野生型擬南芥; OE: 過表達擬南芥。Bar = 1.5 cm。

A–D was seedling growth under the NaCl concentrations of 0 mol L–1, 0.10 mol L–1, 0.15 mol L–1, and 0.20 mol L–1; E: the average main root length ofat different NaCl concentrations. WT: wild type; OE: overexpression.Bar = 1.5 cm.

2.6 轉ZmGRAS31基因擬南芥的耐甘露醇分析

0 mol L–1甘露醇濃度時野生型和轉基因擬南芥均能生長(圖6-A), 當甘露醇濃度為0.15 mol L–1時, 野生型和轉基因擬南芥均能正常生長, 根長沒有明顯差異, 植株均偏小, 側根較少(圖6-B)。當甘露醇濃度為0.30 mol L–1時, 野生型和轉基因擬南芥長勢較弱, 轉基因擬南芥主根比野生型長, 差異不明顯但葉片較黃(圖6-C)。當甘露醇濃度為0.45 mol L–1時, 兩種擬南芥均不能生長, 植株細小, 葉片均發(fā)黃(圖6-D)。統(tǒng)計分析野生型和轉基因擬南芥根長(圖6-E)。

3 討論

轉錄因子是能與真核基因順式作用元件相互作用的DNA結合蛋白, 起激活或者抑制轉錄的作用。GRAS家族是植物所特有的一類轉錄因子, 得名于最先發(fā)現(xiàn)的GAI (gibberellic acid insensitive)、RGA (repressor of GA1-3 mutant) 和SCR (scarecrow)[19]三個成員; 可分為八個亞族。GRAS家族成員眾多, 功能各異, 參與調控許多重要的生理途徑; 然而玉米中只有D8[26]、D9[27]、SCR[28]等少數(shù)幾個成員被報道。本研究克隆了玉米基因的cDNA序列, ZmGRAS31蛋白被定位于細胞核, 具有GRAS轉錄因子家族特有的保守結構域。

圖6 不同甘露醇濃度下轉基因擬南芥根長比較

A~D分別為0 mol L–1、0.15 mol L–1、0.30 mol L–1、0.45 mol L–1甘露醇處理的生長情況; E: 不同甘露醇濃度下擬南芥平均主根長度, WT: 野生型擬南芥; OE: 過表達擬南芥。Bar=1.5 cm。

A–D was seedling growth under the mannitol concentrations of 0 mol L–1, 0.15 mol L–1, 0.30 mol L–1, and 0.40 mol L–1; E: the averagemain root length ofat different mannitol concentrations. WT: wild type; OE: overexpression. Bar = 1.5 cm.

近年來, 越來越多的研究關注GRAS家族在響應植物脅迫中的作用。Tanabe等[29]發(fā)現(xiàn)水稻基因可以通過調控的表達來抑制病原菌侵染水稻后的死亡率, 提高了水稻對病原菌的抗性。李麗麗等[30]研究表明獨行菜基因在低溫脅迫下表達量顯著升高, 推測該基因與獨行菜幼苗耐低溫有關。郭華軍等[31]利用基因組學和生物信息學分析了擬南芥GRAS家族響應滲透和干旱脅迫的表達模式。馬洪雙等[32]將胡楊基因轉入擬南芥, 顯著提高了轉基因擬南芥的抗旱和抗鹽能力。張煥欣等[33]利用生物信息學手段對辣椒GRAS家族基因進行系統(tǒng)鑒定和進化分析, 發(fā)現(xiàn)多數(shù)辣椒GRAS基因能響應PEG-6000和鹽脅迫。郭鵬等[34]發(fā)現(xiàn)轉玉米基因的煙草內葉綠素含量和光合效率均有較大提高, 增強了轉基因植株的抗鹽能力。李慧聰?shù)萚35]發(fā)現(xiàn)玉米基因通過 H2O2信號途徑實現(xiàn)對42oC熱激和ABA脅迫的響應。

本研究表明該基因在不同時期的多種組織中均有表達, 其中以幼根的表達量最高, 其次是雄穗, 因此推測可能參與幼根生長和下胚軸伸長, 而在成熟植株雄穗內可能調控雄配子的形成。同時,在脫水、低溫、高鹽、干旱等逆境處理中的表達量均有不同程度上調, 最高分別能達到對照的18.7、6.6、2.5、15.9倍, 推測參與植株體內抗旱、抗寒及抗鹽等逆境脅迫應答。鹽處理下轉基因擬南芥的主根比野生型長, 差異顯著; 而在甘露醇模擬干旱處理實驗中轉基因擬南芥與野生型無顯著差異。進一步探索基因抗逆機制發(fā)現(xiàn),轉錄起始密碼子上游2 kb的DNA序列有多個與逆境脅迫、光反應等功能相關的順式作用元件。如ABRE、C-repeat/DRE、G-box、MBS、HSE、TC-rich repeats, 它們分別響應ABA、冷/脫水、光、干旱、熱、防御和應激反應。其中ABRE、MBS分別是與ABA、MYB蛋白相關的順式作用元件, 而ABA和MYB類轉錄因子參與調控植物的多種耐鹽、耐旱過程[36-38]。在MaizeGDB (https://www.maizegdb.org/)中查詢結果表明,位于第4染色體210 Mbp~220 Mbp之間并且目前還沒有相關的QTL數(shù)據(jù)。Tuberosa[39]等用Lo964× Lo1016群體研究發(fā)現(xiàn), 在第4染色體的umc66A- umc156A區(qū)段定位到水分脅迫下產量和主胚根長的QTL。潘清春利用478 X Wu312 重組自交系群體研究發(fā)現(xiàn), 在第5和第6染色體上存在根系與產量性狀QTLs連鎖, 并且在第5染色體的bnlg1879- umc1447區(qū)段, 定位到了低氮下最大根長和產量的位點[40]。作為一個轉錄因子, 其表達產物可能會與玉米根長或抗旱相關的QTL結合, 調控玉米的根系發(fā)育進而影響產量。

4 結論

玉米HAM亞族轉錄因子基因的cDNA全長1422 bp, 編碼473個氨基酸, 其編碼蛋白定位于細胞核。正常生長情況下, 該基因在多個玉米組織器官中表達, 其中在幼根中的表達量最高; 該基因響應脫水、高鹽、低溫等逆境脅迫并呈現(xiàn)不同的表達模式; 轉基因擬南芥根長在含0.10 mol L–1、0.15 mol L–1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上與野生型有顯著差異; 而在含梯度濃度甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基上與野生型無明顯差異。

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Cloning and functional analysis ofgene in maize

YIN Long-Fei1,2, WANG Zhao-Yang1, WU Zhong-Yi2, ZHANG Zhong-Bao2,*, and YU Rong1,*

1College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048;2Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Beijing Key Laboratory of Agricultural Gene Resources and Biotechnology, Beijing 100097, China

Thegene family is a kind of plant-specific transcription factor reported in many plants. To figure out the function of maizefamily under stress, we obtained9 (AC: NC_024462) gene from maize () root. Sequence analysis showed that the coding sequence (CDS) ofwas 1422 bp encoding a protein of 473 amino acids with molecular weight of 51,700.38 Da and an isoelectric point of 4.73. Bioinformatics analysis revealed thathad a conserved domain unique to the GRAS transcription factor family and poor hydrophilicity, but no transmembrane structure. Transient expression of maize protoplasts indicated that ZmGRAS31 was localized in the nucleus. Real-time quantitative PCR analysis showed that the expression ofwas up-regulated in maize seedlings under low temperature, dehydration, high salinity and drought conditions. The root length of theoverexpression transgenicplants was longer than that of wide type under different concentrations of NaCl treatments. Therefore, our data suggested thatmight be involved in abiotic stress response.

maize;; transcription factor; protoplast; qPCR; abiotic stress

2018-11-07;

2019-01-19;

2019-03-22.

10.3724/SP.J.1006.2019.83070

于榮, E-mail: yurong@mail.cnu.edu.cn; 張中保, E-mail: zhangzhongbao@baafs.net.cn

E-mail: 18810259769@163.com

本研究由北京市自然科學基金項目(6172007), 國家自然科學基金項目(31871351)和北京市農林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項(KJCX20180404)資助。

This study was supported by the Beijing Natural Science Foundation (6172007), the National Natural Science Foundation of China (31871351), and the Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences (KJCX20180404).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190321.1508.006.html