宋 苗， 劉紅梅， 李 琦， 張 宇， 徐 勇△

(山西醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科， 山西 太原 030000)

抑郁癥是一種慢性精神障礙性疾病，其核心癥狀包括情緒低落、快感缺失、應(yīng)激性、注意力難以集中以及睡眠障礙等，重度抑郁患者會產(chǎn)生自殺觀念和行為[1-2]。目前，臨床上治療抑郁癥的藥物主要通過增加神經(jīng)元突觸間隙單胺類遞質(zhì)濃度起作用，但由于長期服用會出現(xiàn)較嚴重的副作用并且存在有效率低的缺點，因此副作用少、相對溫和的傳統(tǒng)中藥受到人們廣泛的關(guān)注。解郁丸(Jieyuwan)由柴胡、當(dāng)歸、白芍、茯苓、百合、郁金、合歡、甘草、小麥和大棗等10種藥物組成，臨床治療抑郁癥效果良好；有研究表明解郁丸能增加不同腦區(qū)的5羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)和多巴胺(dopamine，DA)等神經(jīng)遞質(zhì)含量[3]；也有研究發(fā)現(xiàn)其抗抑郁作用可能與降低海馬和前額葉皮層單胺氧化酶活性有關(guān)[4]。關(guān)于解郁丸的抗抑郁機制尚未有定論，并且對于該藥的抗抑郁作用與BDNF相關(guān)研究也較少見。

大腦中存在一些腦區(qū)(海馬、前額葉皮層、下丘腦和杏仁核等)和環(huán)路調(diào)節(jié)著情緒、獎賞以及執(zhí)行功能，這些相互關(guān)聯(lián)的邊緣系統(tǒng)的功能失調(diào)與抑郁和抗抑郁作用息息相關(guān)[5]。大量的尸檢[6-7]及影像學(xué)[6, 8]研究表明，抑郁患者海馬及前額葉皮層的灰質(zhì)體積減少，膠質(zhì)細胞密度降低，而這2個腦區(qū)被認為是調(diào)節(jié)抑郁認知的重要區(qū)域[9]。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族中的一種分泌型蛋白。BDNF于1982年被發(fā)現(xiàn)[10]，最初被描述為一種二聚體蛋白[11]，包括成熟BDNF(14 kD)和BDNF前體(32 kD)2種形態(tài)，與抑郁和焦慮密切相關(guān)[12]。對于抑郁癥與BDNF之間的作用，許多研究者發(fā)現(xiàn)BDNF在抑郁癥患者腦內(nèi)表達水平是降低的[13]，經(jīng)過抗抑郁治療后BDNF的表達有所提高。

尋找新的抗抑郁藥物的一個主要問題是缺乏類似抑郁癥并且對抗抑郁治療敏感的動物模型。很早之前有報道指出,Wistar-Kyoto(WKY)大鼠表現(xiàn)出內(nèi)源性抑郁樣行為[14-15]，如WKY大鼠容易出現(xiàn)習(xí)得性無助、在強迫游泳實驗中漂浮不動水平非常高、曠場實驗中活動性較低等。海馬和杏仁核基因表達分析表明，WKY大鼠與慢性應(yīng)激抑郁大鼠的分子機制具有差異性，這表明WKY大鼠不同的分子機制或許可以成為研究新型藥物的目標(biāo)[16]。Wistar大鼠與WKY大鼠屬于同一品系，因此用作對照。

為此，本文主要研究解郁丸是否能夠減少WKY大鼠的抑郁樣行為、效果如何以及抑郁樣行為的改變是否與海馬及前額葉皮層中的BDNF相關(guān)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

成年雄性WKY大鼠和Wistar大鼠，SPF級，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2016-0006。所有大鼠每3只1籠，置于溫度(22±2) ℃，濕度50%～60%的動物房中適應(yīng)1周，期間自由飲食，12 h晝夜循環(huán)(白晝8:00～20:00)。Wistar大鼠10只作為空白對照(control)組，WKY大鼠隨機分為3組，每組10只，分為WKY模型(WKY)組、西酞普蘭(citalopram)組和解郁丸組。各組處理方式為：(1)對照組：生理鹽水灌胃21 d；(2)WKY模型組：生理鹽水灌胃21 d；(3)西酞普蘭組：作為陽性對照，西酞普蘭(10 mg/kg，丹麥靈北藥廠)溶于生理鹽水后灌胃21 d；(4)解郁丸組：解郁丸(212 mg/kg，河南泰豐制藥股份有限公司)用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備混懸液，灌胃21 d。

2 方法

2.1 強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST) 將大鼠放置于一直徑20 cm、高40 cm的透明玻璃筒中，筒中水溫在23～25 ℃，水深17～30 cm，保證大鼠雙后肢不能接觸圓筒底。觀察5 min，記錄分析大鼠漂浮不動時間(此時大鼠在水中漂浮，僅頭部露出水面保持呼吸)。測試結(jié)束后將大鼠擦干，放回籠中。

2.2 糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT) 實驗前2 d為適應(yīng)期，讓大鼠適應(yīng)雙瓶含蔗糖飲水。第1天每只大鼠單獨1籠，每籠放置等量2瓶純水。第2天放置等量的2瓶1%蔗糖水。期間大鼠自由攝食。第3天開始糖水偏好測試，放置等重量2瓶，1瓶為純水，1瓶為1%蔗糖水，測試時間為8:00～14:00，期間每3 h交換1次位置，測試結(jié)束前后稱量2只水瓶，大鼠歸于之前飼養(yǎng)環(huán)境。計算糖水偏好程度：糖水偏好系數(shù)(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

2.3 組織免疫熒光 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(1%，50 mg/kg；Sigma)完全麻醉后，心臟灌流生理鹽水，之后灌注4%多聚甲醛，小心取出腦組織浸泡入4%多聚甲醛后，在4 ℃后固定4～ 6 h，最后浸入30%蔗糖溶液沉底。取出沉底腦組織，濾紙吸干表面水漬，OCT包埋后固定在冰凍切片機中，切片厚度30 μm。貼片后晾干，0.3% Triton-PBS漂洗4次，每次5 min，丙酮-20 ℃固定20 min，同上漂洗4次，5%山羊血清37 ℃封閉60 min，加入 I 抗anti-BDNF antibody(1 500； Abcam)，4 ℃過夜；漂洗4次，加入熒光 II 抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor?488，11 000；Abcam)，避光37 ℃孵育60 min，漂洗，加入DAPI(武漢博士得生物公司)，避光染色15 min，PBS漂洗3次,每次5 min，封片。

2.4 Western blot實驗 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)完全麻醉后，快速取下腦組織，冰上操作取出前額葉皮層和海馬組織，液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。提取組織蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士得生物公司)測定蛋白濃度后將蛋白濃度調(diào)整一致，100 ℃煮蛋白7 min，冷卻后電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，0.3%明膠室溫封閉2 h，I 抗anti-BDNF antibody(15 000；Abcam),4 ℃過夜。TBST洗膜3次,每次5 min， II抗anti-rabbit IgG, HRP-linked Antiboy(12 000； Cell Signaling Technology)室溫1.5 h，TBST洗膜3次,每次5 min，ECL顯影曝光。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用Bonferroni校正t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 強迫游泳實驗的結(jié)果

與正常對照組大鼠相比，WKY大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間明顯增加(P<0.01)，即WKY大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為；但給與解郁丸21 d治療后的WKY大鼠此情況得到逆轉(zhuǎn)，不動時間顯著減少(P<0.01)，且與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1A。

2 糖水偏好程度的結(jié)果

糖水偏好的結(jié)果顯示，WKY模型組大鼠對比正常對照組大鼠，糖水偏好程度明顯降低(P<0.01)，表明WKY大鼠表現(xiàn)出快感缺乏行為；經(jīng)過21 d干預(yù)治療后，解郁丸組大鼠對比模型組大鼠糖水偏好程度明顯提高(P<0.01)，且與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1B。

Figure 1. The results of behavioral experiments. A: the immobility time in forced swimming test; B: the results of sucrose preference test in different groups. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsWKY group.

圖1 行為學(xué)實驗結(jié)果

3 海馬和前額葉皮層檢測BDNF的免疫熒光結(jié)果

運用免疫熒光的方法從形態(tài)學(xué)上直觀地觀測WKY大鼠海馬及前額葉皮層BDNF的表達情況。海馬區(qū)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組WKY大鼠的BDNF表達明顯下降，同時發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)軸突數(shù)目的減少；在解郁丸治療后，BDNF的表達水平有所提高且軸突數(shù)目增加，見圖2。前額葉皮層熒光染色結(jié)果顯示，模型組WKY大鼠的BDNF表達明顯減少，解郁丸與西酞普蘭組大鼠的BDNF表達明顯高于模型組大鼠，見圖3。

4 Western blot檢測海馬和前額葉皮層BDNF蛋白表達的情況

與control組相比，WKY大鼠海馬的BDNF蛋白表達量明顯降低(P<0.01)，前額葉皮層中的表達也降低(P<0.01)，解郁丸與西酞普蘭治療的WKY大鼠海馬(P<0.01)與前額葉皮層(P<0.01)的BDNF水平增加，見圖4。

討 論

對于動物的抑郁樣行為(例如快感缺乏和易產(chǎn)生絕望情緒等)的檢測，我們運用行為學(xué)測試。在強迫游泳實驗中，大鼠在水中漂浮不動的狀態(tài)，反映其在面對無法逃脫的環(huán)境時產(chǎn)生的絕望情緒[17]?？旄腥狈?，是指無法從通常被認為是愉快的活動中體驗到快樂，這種現(xiàn)象是人類嚴重抑郁癥的核心癥狀之一[18-19]。有研究者提出，可用含糖水飲用的減少來反映實驗動物的快感缺失[20]。本文結(jié)果顯示W(wǎng)KY大鼠漂浮不動時間明顯增多，并且對于糖水的喜愛程度也下降，說明了WKY大鼠表現(xiàn)出抑郁的核心特征；而解郁丸具有逆轉(zhuǎn)此結(jié)果的作用，有效減少了WKY大鼠的抑郁樣行為，并且與陽性對照的西酞普蘭組無明顯差異。

Figure 2. The expression of BDNF in hippocampal CA1 region detected by immunofluorescence method. The scale bar=50 μm.

圖2 BDNF在海馬CA1區(qū)中的表達

Figure 3. The expression of BDNF in prefrontal cortex detected by immunofluorescence method. The scale bar=20 μm.

圖3 BDNF在前額葉皮層中的表達

Figure 4. The protein expression of BDNF in rat hippocampus and prefrontal cortex detected by Western blot. Mean±SEM.n=8.

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsWKY group.

圖4 Western blot 檢測BDNF蛋白的表達水平

關(guān)于抑郁的“神經(jīng)因子假說”是指BDNF有促進突觸生長、維持神經(jīng)元生存的作用，各種原因?qū)е履X內(nèi)BDNF缺少、其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的紊亂則會導(dǎo)致抑郁；而抗抑郁治療則是通過增加腦中BDNF的含量、提高突觸的可塑性并促進神經(jīng)元的存活和增殖來發(fā)揮作用[21]。實驗結(jié)果顯示，WKY大鼠BDNF表達是下降的，但在藥物治療后BDNF表達水平顯著上調(diào)，這也就說明解郁丸在抗抑郁治療中會提高海馬和前額葉皮層BDNF的表達水平，符合了該假說。BDNF與特異性受體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)有高度親和力，研究發(fā)現(xiàn)BDNF表達的上調(diào)可增加突觸后的TrkB水平，激活BDNF的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)[5, 22]，MAPK/ERK信號通路的激活可以增加相關(guān)抗凋亡蛋白的合成，從而阻滯神經(jīng)元凋亡。這一系列的反應(yīng)對促進突觸的生長、維持神經(jīng)元生存和增殖有重要意義[23]。在本研究中，我們觀察到BDNF在抗抑郁治療中的改變或許與這種級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

值得注意的是，本研究觀察到免疫熒光中海馬區(qū)可見WKY大鼠神經(jīng)元軸突的減少，而抗抑郁治療后軸突增多，這或許與BDNF在神經(jīng)可塑性中起著關(guān)鍵作用有關(guān)，因有研究表示BDNF影響著突觸重塑、神經(jīng)元發(fā)生、軸突增長以及神經(jīng)元的存活和增殖等過程[24]。BDNF誘導(dǎo)的突觸可塑性和行為改變的關(guān)鍵通路依賴于ERK/CREB信號通路[24]，ERK 是MAPK家族的成員，它被認為是一種生物化學(xué)信號整合器和檢測器，用于協(xié)調(diào)次級通路對細胞外信號的反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性[1]。

本研究運用西酞普蘭作為解郁丸的陽性對照，在各組實驗結(jié)果中二者對WKY大鼠的抗抑郁療效沒有明顯的差異，并且都對海馬和皮層BDNF的表達有影響。但解郁丸作為中藥，成分相對復(fù)雜，其抗抑郁作用可能不是單一機制作用的結(jié)果，所以若要真正明確解郁丸的作用機制或許還需要在多方面同步進行整體性的探究。

doi:10.1038/s41380-019-0415-3.[Epub ahead of print]