李淑華， 高麗蓮， 陳系古， 付 強△， 張齊好

(1 暨南大學生命科學技術學院生物醫(yī)藥研究院， 廣東 廣州 510632； 2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心， 廣東 廣州 510623； 3暨南大學第一附屬醫(yī)院， 廣東 廣州 510632； 4中山大學實驗動物中心， 廣東 廣州 510080)

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是源于骨髓的成體干細胞，具有多向分化潛能，且取材容易，體外易于擴增培養(yǎng)，免疫源性低，便于轉(zhuǎn)染外源基因和調(diào)控蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)MSCs在體內(nèi)、外都具有肝樣細胞分化的潛能[1-2]。優(yōu)化誘導條件，提高MSCs分化效率仍是目前面臨的最大挑戰(zhàn)之一。在MSCs橫向分化為肝樣細胞的研究中，大部分都是通過誘導平板培養(yǎng)中的單層細胞來實現(xiàn)的。在三維立體環(huán)境中，細胞之間的廣泛接觸有助于細胞橋接和緊密連接的形成，這對于保持肝細胞功能穩(wěn)定非常重要[3]。目前在成體干細胞肝樣分化的研究中，無論是平板單層細胞培養(yǎng)，還是三維空間培養(yǎng)，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)都是一種重要的誘導分化因子。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)[4]，懸滴培養(yǎng)為大鼠MSCs(rat MSCs,rMSCs)創(chuàng)造一種球形三維培養(yǎng)微環(huán)境，在HGF的誘導作用下，rMSCs能夠橫向分化為肝樣細胞，具備分泌白蛋白的功能?；诖私Y果，我們以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將人HGF(human HGF,hHGF)導入rMSCs內(nèi)，建立永久表達hHGF的干細胞株，并通過懸滴培養(yǎng)定向誘導，探討其肝樣細胞分化的潛能，為肝臟疾病的細胞治療和生物人工肝提供種子細胞。

材 料 和 方 法

1 材料

L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；FBS(杭州四季青公司)；L-谷氨酰胺(Sigma);HEPES(Sigma); 青霉素和鏈霉素(Amersco);胰島素(Sigma); 氫化可的松(Sigma)。實驗動物為SD大鼠(1月齡)，購于廣東省實驗動物中心，合格證編號為SCXK(粵)2013-0002。使用乙醚麻醉大鼠后予以斷髓處死，在75%的乙醇溶液中浸泡5 min；沿關節(jié)腔位置剪取雙側股骨，剔除附著骨骼上的肌肉和脂肪，以PBS緩沖液沖洗干凈；剪開骨骺端，暴露出骨髓腔，用1 mL注射器吸取培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔；用200目濾網(wǎng)過濾細胞懸液，再加入足量培養(yǎng)液，分裝于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；48 h后，去除未貼壁的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)并傳代擴增。實驗分為rMSCs的懸滴培養(yǎng)組(MSC組)和穩(wěn)定表達人肝細胞生長因子rMSCs(hHGF-rMSCs)的懸滴培養(yǎng)組(H-MSC組)。通過流式細胞儀技術檢測干細胞表面標志分子CD44、CD90、CD34和CD45。FITC標記的抗大鼠CD44和CD90抗體及PE標記的抗大鼠CD45抗體均購自BD；PE標記的抗大鼠CD34抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 建立穩(wěn)定表達hHGF的rMSCs細胞株 整合hHGF cDNA的質(zhì)粒pcDNA3-hHGF由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所王立生教授饋贈。構建質(zhì)粒pLNCX2-hHGF，轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄酶病毒包裝細胞系PT67細胞(廣州中醫(yī)藥大學生化教研室饋贈)。完成病毒包裝后，測定病毒滴度并感染rMSCs。用G418(Amersco；400 mg/L)篩選得到穩(wěn)定表達hHGF的rMSCs(hHGF-rMSCs)。

2.2 hHGF-rMSCs的定向誘導分化和鑒定 將貼壁的rMSCs和hHGF-rMSCs消化成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107/L；以每滴35 μL的體積把細胞懸液均勻地滴加到9 cm培養(yǎng)板上，每板液滴數(shù)量控制在65滴左右；小心地把培養(yǎng)板倒轉(zhuǎn)，置于37℃培養(yǎng)葙中；培養(yǎng)至第3天，收集懸滴置于培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，通過不斷反復晃動和小心吹打，使細胞球保持懸浮生長的狀態(tài)；培養(yǎng)至第7天，留取部分細胞做相應檢測后，把細胞球消化成單細胞懸液，重新懸滴培養(yǎng)；培養(yǎng)至第14天，同樣留取部分細胞做相應檢測后，再把細胞球消化成單細胞懸液，重新懸滴培養(yǎng)至第21天。

2.3 RNA提取和RT-qPCR實驗 按照QIAGEN RNeasy Mini Kit(Qiagen)的操作方法分別提取懸滴培養(yǎng)后第7、14和21天細胞球的總RNA，檢測RNA濃度和純度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肂io-Rad的cDNA Synthesis Kits把RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量PCR使用Bio-Rad的SsoAdvancedTMUniversal Supermixes 試劑盒進行，并用熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進行擴增和監(jiān)測。白蛋白(albumin，ALB)的上游引物序列為5’-TCTATGCCCCAGAACTCCTT-3’, 下游引物序列為5’- CTTTCTCTTTCACGGCATCA-3’, qPCR退火溫度為55 ℃, 30個循環(huán), 產(chǎn)物120 bp；甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)的上游引物序列為5’-GGACTGGCCGACATTTACAT-3’,下游引物序列為5’-CCCTCAGAAAGCTGGTGATG-3’, qPCR退火溫度為55 ℃，36個循環(huán), 產(chǎn)物130 bp；角蛋白18(cytokeratin-18，CK-18)的上游引物序列為5’-GGAATCAGAGCTGGCACAAA-3’,下游引物序列為5’-GCGTCGTTGAGACTGAAATC-3’, qPCR退火溫度為60 ℃, 36個循環(huán), 產(chǎn)物150 bp；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’, 下游引物序列為5’-AAGATGGTGATGGGATTTC-3’, qPCR退火溫度為60 ℃, 30個循環(huán), 產(chǎn)物226 bp。

2.4 免疫熒光檢測 將懸滴培養(yǎng)后第7、14和21天的細胞球消化、離心涂片，用4%多聚甲醛固定，檢測細胞內(nèi)ALB、AFP和CK-18蛋白的表達。PBS清洗后，用0.1%Triton X-100作用20 min；隨后用山羊封閉血清在37 ℃下處理30 min；加入按1100稀釋的Ⅰ抗后4 ℃孵育過夜；次日用PBS徹底清洗未結合的I抗，加入按180稀釋的II抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗后再加入1 mmol/L Hoechst 33258，孵育10 min；PBS沖洗后封片，激光共聚焦顯微鏡(LSM 510 META，Leica)下觀察并記錄結果?？勾笫驛LB購自DAKO，抗大鼠AFP抗體購自Santa Cruz，抗大鼠CK-18抗體購自博士德，Cy3標記的抗小鼠IgG，F(xiàn)TTC標記的抗兔IgG和Hoechst 33258均購自Sigma。

2.5 ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的ALB 留取懸滴培養(yǎng)后第7、14和21天的培養(yǎng)上清檢測ALB的分泌量。配備所有試劑、標準品和檢測樣品，整個操作在室溫下按照Assay Max Rat ALB ELISA Kit(Assaypro)進行。選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀(Power Wave XS microplate spectrophotometer，BioTek)上讀取各孔吸光度(A)值。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，統(tǒng)計學處理利用SPSS 20.0軟件，組間比較采用雙因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 rMSCs表面標志分子流式細胞術鑒定

流式細胞術結果顯示，提取培養(yǎng)的rMSCs中CD44的陽性表達率為99.6%，CD90的陽性表達率為99.5%，CD34的陽性表達率為0.88%，CD45的陽性表達率為0.60%，見圖1。結果表明分離的細胞是rMSCs。

Figure 1. Identification of surface marker for rMSCs.

圖1 rMSCs表面標志分子的鑒定

2 hHGF-rMSCs細胞株的鑒定

提取hHGF-rMSCs的總RNA進行電泳，可以清晰地觀察到18S和28S 2個條帶，提示RNA可用。RT-PCR擴增后，我們獲得了大小為514 bp的hHGF cDNA條帶，見圖2A。hHGF-rMSCs爬片并固定后，進行免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，細胞胞漿內(nèi)大量表達hHGF蛋白，呈現(xiàn)綠色熒光的陽性細胞，見圖2B。在連續(xù)培養(yǎng)的21 d內(nèi)，hHGF的分泌量基本保持在穩(wěn)定水平，見圖2C。說明成功構建了hHGF-rMSCs細胞株。

Figure 2. The identification of hHGF-rMSCs. A: hHGF cDNA analysis by RT-PCR; B: immunofluorescence staining of hHGF; C: secretion of hHGF in cultured supernatant.

圖2 hHGF-rMSCs細胞株的鑒定

3 定向誘導hHGF-rMSCs分化為肝樣細胞

3.1 RT-qPCR檢測肝特異蛋白在mRNA水平的表達 RT-qPCR結果顯示，懸滴培養(yǎng)的hHGF-rMSCs中，在第7～21天都呈現(xiàn)ALB、AFP和CK-18 mRNA的高表達，在同一時點上與rMSCs比較均具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。在不同時點比較，hHGF-rMSCs中ALB、AFP和CK-18 mRNA各自的表達無顯著性差異，見圖3。

Figure 3. Hepatic special gene expression of hHGF-rMSCs in hanging drop. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMSC group.

圖3 懸滴培養(yǎng)hHGF-rMSCs中肝特異蛋白在mRNA水平上的表達

3.2 免疫熒光檢測細胞內(nèi)的蛋白表達 懸滴培養(yǎng)hHGF-rMSCs內(nèi)AFP在第7和14天為陰性表達，在第21天開始出現(xiàn)陽性表達；而ALB和CK-18這2種蛋白，在第7天就呈現(xiàn)較強陽性表達，并持續(xù)到第21天。懸滴培養(yǎng)的rMSCs中，AFP、ALB和CK-18蛋白的表達在第7到21天始終呈現(xiàn)陰性,見圖4。

Figure 4. The expression of AFP, ALB and CK-18 protein in hHGF-rMSCs which cultured in hanging drop.

圖4 懸滴培養(yǎng)hHGF-rMSCs中AFP、ALB和CK-18蛋白的表達

3.3 ELISA法檢測ALB的分泌 在第7、14和21天，ELISA法檢測到懸滴培養(yǎng)后hHGF-rMSCs的ALB分泌量分別為(38.19±1.73)、(43.36±3.06)和(47.76±2.83)μg/L，較rMSCs顯著升高(P<0.01)，在不同時點比較，hHGF-rMSCs中ALB的分泌量無顯著性差異，見圖5。

Figure 5. ALB secretion of hHGF-rMSCs in cultured supernatant. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMSC group.

圖5 懸滴培養(yǎng)hHGF-rMSCs中ALB的分泌

討 論

在干細胞橫向分化為肝樣細胞的研究中，最初主要是通過多種因子共同作用，誘導平板培養(yǎng)中的單層細胞來實現(xiàn)的[5]；但細胞脫離了體內(nèi)三維生長環(huán)境，難以維持和行使正常的生物學功能。研究者發(fā)現(xiàn)，肝樣分化的MSCs能自我形成球樣結構，很好地維持其分化成熟狀態(tài)，并顯示出良好的生物轉(zhuǎn)化能力，有可能成為體外毒理學評價的細胞模型[6]。使用基質(zhì)包被、微載體和微囊等球形聚集培養(yǎng)[7]，與肝非實質(zhì)細胞[8]、干細胞[9]或其它細胞[10]共培養(yǎng)，在三維培養(yǎng)環(huán)境中能顯著延長肝細胞的存活時間，增強和保持肝細胞生物活性。

在HGF的誘導下，接種于由膠原、聚己內(nèi)酯和聚醚砜組成的毫微纖維支架的人MSCs，對比平面培養(yǎng)能夠獲得更多具有生成白蛋白、尿素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等功能的肝樣細胞[11]。Hayashi等[12]和Li等[13]分別以質(zhì)粒DNA和腺病毒顆粒的形式，將hHGF由尾靜脈注射導入小鼠體內(nèi)，結果均顯示，hHGF可以明顯減輕肝硬化小鼠肝細胞損傷程度，促進肝細胞再生，并提升肝功能。在體外，轉(zhuǎn)染hHGF的肝細胞也可以拮抗CCl4引起的肝細胞毒性損傷，提高其生存率[14]。hHGF主要通過抑制TGF-β1的分泌和膠原的合成，從而達到減輕肝纖維化形成的效果[15]。

我們直接將hHGF導入rMSCs內(nèi)，使rMSCs自行分泌hHGF，并進行懸滴培養(yǎng)，探討其肝樣細胞分化的潛能。結果證實，hHGF-rMSCs經(jīng)過懸滴培養(yǎng)后，能夠被誘導為表達肝特異蛋白，并分泌ALB的肝樣細胞。以逆轉(zhuǎn)錄病毒介導hHGF的轉(zhuǎn)染，一方面可以使MSCs持續(xù)生成和分泌hHGF；另一方面，MSCs還可以通過體外誘導橫向分化為肝樣細胞。該細胞的成功構建將為臨床肝臟疾病的治療帶來新的啟發(fā)。