欒明月， 閆文帝， 劉特思， 呂 游， 佐藤保則， 樸英實(shí)， 任香善△

(1 延邊大學(xué)腫瘤研究中心， 吉林 延吉 133002； 2金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)部形態(tài)機(jī)能病理學(xué)教研室， 日本 金澤 9208640)

Caroli病(Caroli disease)是膽管末梢以進(jìn)行性、多發(fā)性囊狀擴(kuò)張為特征的疾患，常合并先天性肝纖維化(congenital hepatic fibrosis，CHF)，是常染色體隱性遺傳性多囊腎(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)的肝膽管病變[1-2]，其確切發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，目前主要有膽管板畸形(ductal plate malformation，DPM)學(xué)說(shuō)和基因突變學(xué)說(shuō)，其中基因突變學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，膽管形成時(shí)期上皮細(xì)胞過(guò)度增殖，其遠(yuǎn)端因長(zhǎng)期受阻而逐漸擴(kuò)張呈囊狀，近端受阻程度不同，形成大小不一的囊腫[3]。研究表明，YAP信號(hào)通路和PI3K/mTOR信號(hào)通路的過(guò)度活化都可導(dǎo)致多囊腎(polycystic kidney, PCK)大鼠肝囊腫上皮細(xì)胞的過(guò)度增殖[4-5]。PCK大鼠是Caroli病的一種動(dòng)物模型，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)膽管進(jìn)行性囊性擴(kuò)張和門(mén)靜脈周?chē)w維化[6]。目前對(duì)膽管擴(kuò)張機(jī)制的研究很少，而對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在膽管擴(kuò)張中的作用機(jī)制尚無(wú)明確報(bào)道。本研究旨在探討VEGF對(duì)膽管上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的影響，為Caroli病的臨床治療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)中使用的正常10月齡SD大鼠和PCK大鼠，均購(gòu)自日本查爾斯河實(shí)驗(yàn)室，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照日本金澤大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南進(jìn)行[6]。實(shí)驗(yàn)大鼠用乙醚麻醉后，頸椎脫臼法致死，取出肝臟并浸泡在10%的中性福爾馬林緩沖溶液中(pH 7.4)固定24～48 h，切病變肝組織制備石蠟標(biāo)本。石蠟標(biāo)本切成4 μm厚的切片，備免疫組織化學(xué)染色時(shí)用。PCK大鼠和正常大鼠的膽管上皮細(xì)胞由日本金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)部形態(tài)機(jī)能病理學(xué)教研室提供。膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM/F-12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、5 μmol/L毛喉素、20 μg/L表皮生長(zhǎng)因子和1%青-鏈霉素)，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rat aortic endothelial cells, RAoECs)購(gòu)買(mǎi)自Cell Applications，用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。為檢測(cè)膽管上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)血管的作用，膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)72 h后取其上清，按20%的濃度加入到內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。

2 主要試劑

抗VEGF抗體購(gòu)自Abcam(1100，鼠單克隆抗體); 抗CD31抗體購(gòu)自Santa Cruz(1100，兔多克隆抗體);SYBR Green PCR Mix購(gòu)自日本東洋紡生物科技有限公司;堿性磷酸酶標(biāo)記的聚合物購(gòu)自Nichirei Tokyo;合成的VEGF小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)、陰性對(duì)照siRNA(negative siRNA)及HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Qiagen。

3 主要方法

3.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠肝組織中VEGF和CD31表達(dá)情況 VEGF(n=6)和CD31(n=10)的免疫組織化學(xué)染色采用EnVision法，切片常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)用10 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖劑(pH 6.0)微波加熱。用過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶，Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。CD31抗體用Vector Red堿性磷酸酶底物試劑盒(Vector Laboratories)進(jìn)行顯色反應(yīng)。每張切片取5個(gè)門(mén)脈區(qū)的視野，用ImageJ 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3.2 RT-PCR和RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞，用RNA提取試劑盒抽提總RNA。取1 μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。PCR終產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。引物序列如下：GAPDH的上游引物序列為5′-GAGTCAACGGGATTTGGTCGT-3′，下游引物序列為5′-TTGATTTTGGAGGGATCTC-3′;VEGF的上游引物序列為5′-AGTGGTCCAGGCTGCAC-3′，下游引物序列為5′-TCCATGAACTTCCCACTTCGT-3′。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，使用SYBR Green PCR Mix，在Mx3005P檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)條件：50 ℃溫育2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 40個(gè)循環(huán)15 s，60 ℃ 1 min。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 使用大鼠VEGF ELISA試劑盒(R&D Systems)檢測(cè)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF蛋白水平。

3.4 WST-1比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 用50 μg/L的重組VEGF處理正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞,72 h后測(cè)定細(xì)胞活力。大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分別用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液和含20%膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后測(cè)定其活力。

3.5VEGF基因沉默實(shí)驗(yàn)VEGF基因的沉默效果用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。將2×104個(gè)膽管上皮細(xì)胞接種于96孔板中，用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液孵育24 h后換為含10 nmol/L的siRNA和0.75 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑的混合液繼續(xù)孵育48 h，加入50 μg/L的VEGF處理內(nèi)皮細(xì)胞48 h后測(cè)定其增殖活性。

3.6 VEGF受體抑制劑SU5614處理后檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活力 用VEGF受體抑制劑SU5614(10 μmol/L)處理膽管上皮細(xì)胞(48 h)，觀察膽管上皮細(xì)胞活力。將總計(jì)為1×104個(gè)的膽管上皮細(xì)胞接種于96孔板中，用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液孵育24 h后換為VEGF受體抑制劑SU5614，繼續(xù)孵育48 h。

3.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定RAoECs的遷移能力。在上室區(qū)，接種約5×104個(gè)細(xì)胞于無(wú)血清培養(yǎng)液中。在下室區(qū)，加入含10%胎牛血清的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液或含20%的大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞用100%的甲醇固定并用蘇木精染色。光學(xué)顯微鏡下可觀察到遷移至膜底部的細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域?qū)?xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.8 管腔形成實(shí)驗(yàn) 管腔形成實(shí)驗(yàn)利用的是生長(zhǎng)因子減少的基底膜基質(zhì)。將500 μL基質(zhì)膠鋪在24孔板中，37 ℃孵育30 min待基質(zhì)膠凝固，5×104個(gè)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于基質(zhì)膠上。細(xì)胞在無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。然后換為基礎(chǔ)培養(yǎng)液或含有20%大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔長(zhǎng)度用ImageJ進(jìn)行定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 VEGF在正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)10月齡大鼠肝組織切片中VEGF的表達(dá)水平。正常大鼠膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中VEGF呈弱陽(yáng)性表達(dá)，PCK大鼠的膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中VEGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖1A。RT-qPCR和ELISA結(jié)果顯示，PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞的VEGF mRNA表達(dá)水平和上清液中的蛋白表達(dá)量顯著高于正常大鼠(P<0.01)，見(jiàn)圖1B、C。

Figure 1. Expression of VEGF in the normal and PCK rat livers. A: the expression of VEGF in the liver tissues detected by immunohistochemical staining (scale bar=20 μm); B: the mRNA expression of VEGF in PCK rat cholangiocytes detected by RT-qPCR; C: the VEGF protein in culture supernatant detected by ELISA. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsnormal. Arrows indicate interlobular bile ducts of normal rats and PCK rats.

圖1 VEGF在正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2 PCK大鼠肝匯管區(qū)新生微血管密度測(cè)定

免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示，PCK大鼠的肝內(nèi)膽管周?chē)⒀軘?shù)量顯著增多；微血管密度分析結(jié)果示PCK大鼠肝匯管區(qū)微血管密度顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The microvessel density of the normal and PCK rat livers. The liver sections were immunostained with CD31 antibody. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsnormal.

圖2 正常大鼠及PCK大鼠肝門(mén)管區(qū)新血管形成情況和微血管密度分析

3 VEGF可增強(qiáng)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞活力

WST-1比色法結(jié)果表明，VEGF處理后PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞增殖活性顯著提高(P<0.01)，而正常膽管上皮細(xì)胞活力幾乎不變，見(jiàn)圖3A。用VEGF受體抑制劑SU5614處理后，膽管上皮細(xì)胞活力受抑制(P<0.01)，見(jiàn)圖3B。VEGF基因的沉默效果用RT-PCR方法驗(yàn)證，見(jiàn)圖3C。VEGF基因沉默后VEGF增強(qiáng)膽管上皮細(xì)胞活力的作用降低(P<0.01),見(jiàn)圖3D。

Figure 3. Effects of VEGF, SU5614 andVEGFsiRNA on the viability of PCK rat cholangiocytes. A： WST-1 assay was used to determine the effect of VEGF on the viability of cholangiocytes in the normal and PCK rats; B: the effect of VEGF receptor inhi-bitor SU5614 on the viability of cholangiocytes was detected by WST-1 assay; C: the gene-silencing effect ofVEGFsiRNA was detected by RT-PCR assay; D:VEGFsiRNA could reduce the promoting effect of VEGF on the viability of cholangiocytes. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖3 VEGF、VEGF受體抑制劑SU5614及VEGFsiRNA對(duì)PKC大鼠膽管上皮細(xì)胞的影響

4 PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力、遷移及管腔形成的影響

與基礎(chǔ)培養(yǎng)液相比，含正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力顯著提高，而PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞上清液對(duì)細(xì)胞活力的增強(qiáng)作用比正?；騼?nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液更顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。

內(nèi)皮細(xì)胞游走實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞游走數(shù)量顯著高于基礎(chǔ)培養(yǎng)液組和加入正常大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液組(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液組血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔完整性和長(zhǎng)度顯著高于基礎(chǔ)培養(yǎng)液和加入正常大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液組(P<0.01)，見(jiàn)圖4C。

Figure 4. The effects of cholangiocyte culture supernatant on endothelial cell viability (A,n=6), migration (B,n=10) and tube formation (C,n=3). The scale bar=50 μm. Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vsbasal medium group;#P<0.05vsnormal supernatant group.

圖4 正常和PCK大鼠的膽管上皮細(xì)胞上清液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力、遷移及管腔形成的影響

討 論

膽管囊狀擴(kuò)張是Caroli病的一種常見(jiàn)病變特點(diǎn)，膽管上皮細(xì)胞的過(guò)度增生是引起膽管擴(kuò)張的主要機(jī)制之一[7-8]。VEGF是一種具有分泌特性的外分泌蛋白，它與特定受體結(jié)合，激活多種信號(hào)通路，從而使血管通透性增加、促進(jìn)新生血管形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[9-10]。

本研究表明，PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平顯著高于正常大鼠膽管上皮細(xì)胞。因此，我們推測(cè)Caroli病的膽管囊性擴(kuò)張可能與VEGF的表達(dá)水平有關(guān)，高表達(dá)的VEGF可能會(huì)通過(guò)自分泌和旁分泌的形式影響膽管上皮細(xì)胞增殖。Franchitto等[11]表明，增生的膽管上皮細(xì)胞獲得顯性神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特性，并分泌不同的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽和激素等調(diào)節(jié)膽管細(xì)胞的增殖或凋亡。本研究采用WST-1比色法分析了正常和PCK大鼠的膽管上皮細(xì)胞活力，檢測(cè)到用重組VEGF刺激后，正常大鼠膽管上皮細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，但PCK大鼠的膽管上皮細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，提示VEGF能夠增強(qiáng)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞活力，在Caroli病的膽管擴(kuò)張中發(fā)揮重要作用。

當(dāng)用siRNA技術(shù)干擾VEGF表達(dá)時(shí)，膽管上皮細(xì)胞活力明顯降低，提示VEGF增強(qiáng)膽管上皮細(xì)胞活力是膽管擴(kuò)張的主要機(jī)制之一。而VEGF受體抑制劑SU5614同樣降低膽管上皮細(xì)胞的活力。

免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果提示，PCK大鼠肝匯管區(qū)微血管密度顯著增加。因此，我們推測(cè)膽管囊性擴(kuò)張與肝匯管區(qū)的微血管密度存在聯(lián)系，膽管上皮細(xì)胞能夠分泌促血管生成因子，促進(jìn)血管新生，進(jìn)而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。盡管不同的細(xì)胞外信使及其受體已被報(bào)道能調(diào)節(jié)膽管上皮細(xì)胞增殖，膽管上皮細(xì)胞反應(yīng)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚未清楚[11-12]。我們的實(shí)驗(yàn)在證明了膽管上皮細(xì)胞具有分泌VEGF功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯提高，進(jìn)一步說(shuō)明VEGF這一信號(hào)分子能夠影響血管生成而增強(qiáng)膽管上皮細(xì)胞活力，即膽管細(xì)胞的功能性改變導(dǎo)致其過(guò)量分泌VEGF，最終影響膽管的病理生理學(xué)改變。

Morell等[13]報(bào)道膽管內(nèi)VEGF-A由膽管細(xì)胞產(chǎn)生，作用于內(nèi)皮細(xì)胞及其前體細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈血管生成，同時(shí)也報(bào)道了膽管板細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF濃度隨著膽管的發(fā)育和血管生成素系統(tǒng)的聯(lián)合作用而增加。這些結(jié)果提示，VEGF不僅能直接誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞增殖，而且能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，最終導(dǎo)致新生血管形成，新生的血管通過(guò)旁分泌作用，再次促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致膽管擴(kuò)張。將VEGF及其受體作為新的治療靶點(diǎn)，可有效抑制膽管上皮細(xì)胞的過(guò)度增生及新生血管的形成，對(duì)膽管囊性擴(kuò)張的治療提供了新的臨床希望。

綜上所述，我們總結(jié)出如下膽管囊性擴(kuò)張的機(jī)制：PCK膽管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)旁分泌和自分泌的形式分泌VEGF，分泌的VEGF既影響膽管周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新生微血管形成，又能夠與膽管上皮細(xì)胞上的FIk-1和FIt-1受體結(jié)合，促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞增殖。新生的微血管再次影響膽管上皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞過(guò)度增殖最終導(dǎo)致膽管囊性擴(kuò)張，見(jiàn)圖5。因此，PCK大鼠的膽管擴(kuò)張可能與VEGF直接誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞增殖或通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移形成新生血管有關(guān)，探究VEGF對(duì)這2種途徑的具體作用機(jī)制將有利于Caroli病的診治。

Figure 5. The possible mechanisms of excessive secretion of VEGF promoting the proliferation of bile duct epithelial cells and biliary cystic dilation.

圖5 VEGF致膽管囊性擴(kuò)張的可能機(jī)制