師 婷, 宋維芳， 孫長(zhǎng)偉， 祝世功△

(1 山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 山西 汾陽(yáng) 032200； 2北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 北京 100191)

活性肽ghrelin是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種含28個(gè)氨基酸的腦腸肽，它是孤兒受體生長(zhǎng)激素釋放劑受體1α亞型(growth hormone secretagogue receptor type 1α, GHSR-1α)第1個(gè)內(nèi)源性配基。研究表明，GHSR-1α是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在體內(nèi)分布廣泛，ghrelin通過(guò)與GHSR-1α相結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放、調(diào)節(jié)攝食和能量平衡、促進(jìn)胃酸分泌和胃腸蠕動(dòng)，以及調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶等功能[1-3]。近年來(lái)，在多種神經(jīng)疾病動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中已證實(shí)，ghrelin具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，如腦缺血再灌注損傷模型[4]，老年性癡呆，即阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型[5]和實(shí)驗(yàn)性帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型[6]等。Ghrelin發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制較為復(fù)雜，至今還不完全清楚。對(duì)于不同原因誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，ghrelin作用的受體后機(jī)制也不盡相同，如在大腦中動(dòng)脈閉塞(middle crebral artery occlusion, MCAO)動(dòng)物模型中，ghrelin可上調(diào)促凋亡基因Par-4的表達(dá)[7]；在體外氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型中，ghrelin可通過(guò)PI3K/ERK1/2信號(hào)通路抑制大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[8]；在PD模型中，ghrelin 可通過(guò)AMPK 途徑抑制MPTP誘導(dǎo)的黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)元損傷[9]；在AD模型中，ghrelin增加了SATA-3和MAPK的磷酸化，改善AD大鼠的癥狀[10]；在谷氨酸誘導(dǎo)的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷模型中，ghrelin可通過(guò)ERK1/2和PI3K/ Akt 通路發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[11]；在視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷中，ghrelin可上調(diào)Akt和mTOM,減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)元的自噬和凋亡[12]。

我們前期研究證明，ghrelin可抑制H2O2、興奮性氨基酸及OGD誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠腦皮層神經(jīng)元凋亡；也可抑制MCAO大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷，減小腦梗死的體積。Ghrelin通過(guò)GHSR-1α上調(diào) Bcl-2/Bax 比值和熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)的表達(dá),抑制caspase-8,caspase-9和caspase-3的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用[4]。為進(jìn)一步探討ghrelin上調(diào)HSP70發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，我們利用神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，證明ghrelin通過(guò)上調(diào)HSP70抑制ASK1的活化，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[13]。然而，ghrelin上調(diào)HSP70的機(jī)制尚需探究。鑒于ERK信號(hào)通路在多種神經(jīng)損傷的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制中具有重要作用，我們推測(cè)，ERK信號(hào)通路也可能在ghrelin上調(diào)HSP70高表達(dá)及抑制硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要的受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

PC12細(xì)胞系由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部神科所王曉民教授課題組惠贈(zèng)。

2 主要試劑

Ghrelin購(gòu)自Phoenix；SNP和槲皮素(quercetin)購(gòu)自Sigma；PD98059購(gòu)自Merck-Calbiochem；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清和馬血清購(gòu)自Gibco；抗熱休克蛋白70、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellcular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)與磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2，p-ERK1/2)抗體購(gòu)自CST；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自北京中杉金橋公司；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 按照前期研究的方法[13]，將凍存的PC12細(xì)胞株從液氮罐中取出，放入37 ℃水浴缸中，輕輕搖晃使其快速融化。用無(wú)菌吸管吸出細(xì)胞懸液，移至離心管中，加入10倍體積含10%胎牛血清和5%馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，混勻后, 100×g離心5 min，用培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%時(shí)傳代。棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，用PBS液洗1次，然后加入0.05%胰蛋白酶消化液，光鏡下觀察，約1～2 min后細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞間隙變大，棄去消化液，迅速加入含血清的培養(yǎng)液1.5 mL終止消化。用吸管吹打，使細(xì)胞變成單細(xì)胞懸液，100×g離心5 min，棄上清，按13傳代。

3.2 PC12細(xì)胞凋亡模型的建立及給藥方案 按照前期研究方法復(fù)制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡模型[13]。簡(jiǎn)言之，將PC12細(xì)胞傳代培養(yǎng)5 d，實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分裝于包被多聚賴氨酸的6孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)液替換為低血清RPMI-1640培養(yǎng)液(含1%FBS)使細(xì)胞同步化，24 h后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。Ghrelin預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)為30 min。使用一氧化氮(nitric oxide, NO)供體SNP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡時(shí)間通過(guò)實(shí)驗(yàn)指示為18 h。 Quercetin的使用： ghrelin預(yù)處理前60 min加入10 μmol/L quercetin。PD98059的使用：ghrelin預(yù)處理前60 min 加入PD98059(10 μmol/L)阻斷ERK的激活。

3.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 各組PC12細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗2次，RIPA法冰上提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5× SDS上樣緩沖液，96 ℃加熱6 min，以β-actin為內(nèi)參照，12% SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，麗春紅染色確定條帶位置并進(jìn)行剪裁，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入I抗4℃孵育過(guò)夜，加入II抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色。掃描并用軟件分析灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集不低于106個(gè)PC12細(xì)胞，離心，固定過(guò)夜，重懸后加入RNA酶，37 ℃水浴30 min。300目濾膜除去細(xì)胞團(tuán)塊，加入1～2滴PI染液，混勻后立即在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。亞G1峰數(shù)值作為凋亡定量觀察指標(biāo)。

3.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將各組細(xì)胞用PBS清洗后，迅速經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，加入0.5% Triton X-100處理20 min，并用5%BSA封閉30 min。后加入兔源HSP70抗體(1200)4 ℃孵育過(guò)夜。用PBS 洗3遍后，加入山羊抗兔IgG(1500)室溫下孵育2 h，進(jìn)行DAB染色，通過(guò)顯微鏡進(jìn)行圖像觀察。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以GraphPad Prism 5.0軟件分析作圖。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 Ghrelin對(duì)NO誘導(dǎo)的PC12凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示， 與對(duì)照組比較，0.5 mmol/L SNP處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間后，各組細(xì)胞的凋亡率均顯著增加(P<0.05)；與SNP損傷組比較，10 nmol/L ghrelin預(yù)處理12 h和18 h，PC12細(xì)胞的凋亡率顯著減少(P<0.05)，而ghrelin預(yù)處理24 h，PC12細(xì)胞的凋亡率與SNP損傷組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖1。

2 Ghrelin對(duì)PC12細(xì)胞HSP70表達(dá)的影響

3種濃度(1、10和100 nmol/L)的ghrelin分別預(yù)處理PC12細(xì)胞30 min，再暴露于0.5 mmol/L SNP18 h后，Western blot結(jié)果顯示，與SNP損傷組比較，1 nmol/L ghrelin處理組的HSP70表達(dá)無(wú)顯著差異；10 nmol/L ghrelin處理組HSP70的表達(dá)顯著增多(P<0.05)；100 nmol/L ghrelin處理組HSP70增加更顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。進(jìn)一步觀察 ghrelin預(yù)處理對(duì)SNP損傷4個(gè)時(shí)點(diǎn)(6 h、12 h、18 h和24 h)的效應(yīng)，結(jié)果表明，在SNP損傷18 h，ghrelin上調(diào)HSP70表達(dá)作用最顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2B?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇SNP損傷18 h，ghrelin濃度為100 nmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，SNP損傷組PC12細(xì)胞HSP70表達(dá)呈弱陽(yáng)性，而ghrelin預(yù)處理后的SNP損傷組PC12細(xì)胞HSP70表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，見(jiàn)圖2C。

Figure 1. The effects of ghrelin on the apoptosis of PC12 cells induced by SNP. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsSNP group.

圖1 Ghrelin對(duì)SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

3 HSP70抑制劑quercetin消減ghrelin的抗凋亡效應(yīng)

與SNP損傷組比較，ghrelin顯著上調(diào)HSP70的表達(dá)(P<0.05)；與ghrelin預(yù)處理組比較，quercetin 顯著削減ghrelin引起的HSP 70 高表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與SNP損傷組比較，ghrelin處理組凋亡率顯著降低(P<0.05)；與ghrelin處理組比較，quercetin預(yù)處理顯著削弱ghrelin的抗凋亡作用(P<0.05)；單獨(dú)使用quercetin處理，PC12細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3B、C。

Figure 2. Ghrelin upregulated the expression of HSP70 in SNP-damaged PC12 cells.A: the effects of three doses of ghrelin on HSP70 expression were detected by Western blot; B: the effects of ghrelin on HSP70 expression at different times after SNP-damaged PC12 cells; C: the positive expression of HSP70 in PC12 cells were detected by immunocytochemical staining(×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSNP group;#P<0.05vsghrelin (10 nmol/L)+SNP group.

圖2 Ghrelin上調(diào)SNP損傷的PC12細(xì)胞HSP70蛋白的表達(dá)

Figure 3. Effect of quercetin on the anti-apoptotic effects of ghrelin in SNP-damaged PC12 cells. A:quercetin blocked the effect of HSP70 upregulaiton induced by ghrelin; B: the apoptosis rate of the PC12 cells induced by SNP with or without quercetin was detected by flow cytometry; C: the statistical result of B. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSNP group；#P<0.05vsghrelin+SNP group.

圖3 HSP70抑制劑quercetin 對(duì)ghrelin 抗PC12細(xì)胞凋亡作用的影響

4 ERK1/2磷酸化對(duì)ghrelin誘導(dǎo)的HSP70高表達(dá)的影響

采有Western blot法檢測(cè)ghrelin對(duì)PC12細(xì)胞ERK1/2磷酸化的影響，結(jié)果表明，ghrelin預(yù)處理后30 min，ERK1/2磷酸化水平開(kāi)始升高(P<0.05)，2 h達(dá)到峰值(P<0.05)，4 h后ERK1/2磷酸化水平逐漸減弱，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖4A。進(jìn)一步觀察ERK1/2磷酸化與ghrelin誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果表明，與單純ghrelin處理組比較，應(yīng)用ERK1/2抑制劑PD98059阻斷ERK1/2的激活，ERK1/2阻斷劑組HSP70的表達(dá)變化水平顯著降低(P<0.05)，而單獨(dú)使用PD98059對(duì)HSP70表達(dá)無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖4B。

Figure 4. Ghrelin upregulating HSP70 expression in SNP-damaged PC12 cells were mediated by ERK 1/2 phosphorylation. A： the effects of ghrelin on the expression of ERK1/2 at different times in PC12 cells were detected by Western blot; B： the effects of PD98059 on the expression of HSP70 induced by ghrelin in SNP-damaged PC12 cells were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSNP group；#P<0.05vsghrelin+SNP group.

圖4 ERK1/2磷酸化介導(dǎo)ghrelin上調(diào)HSP70表達(dá)減輕PC12細(xì)胞損傷

討 論

內(nèi)源性活性肽ghrelin通過(guò)其受體GHSR發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，并在多種神經(jīng)疾病, 如腦卒中、阿爾茨海默病和帕金森癥等神經(jīng)損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。大量的資料表明，氧化應(yīng)激參與上述神經(jīng)疾病的發(fā)病[14-15]。采用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞系損傷模型，常應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)及藥物研究。PC12細(xì)胞是最早被用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的神經(jīng)細(xì)胞株,硝普鈉常被用作氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷和凋亡[16-18]。我們前期研究證明，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建ASK1過(guò)表達(dá)的PC12細(xì)胞，證明在SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡模型中，ghrelin可顯著上調(diào)HSP70表達(dá)，后者通過(guò)抑制ASK1活性減輕SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[13]。本研究采用同樣的細(xì)胞損傷模型，從HSP70的上游探討ghrelin抑制SNP損傷PC12細(xì)胞的受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 Ghrelin受體GSHR-1α為一種G蛋白偶聯(lián)受體，可通過(guò)不同的受體后機(jī)制發(fā)揮多種功能生物學(xué)功能。本研究首先探究了ERK1/2信號(hào)通路是否介導(dǎo)ghrelin上調(diào)HSP70表達(dá)。根據(jù)前期研究方法，實(shí)驗(yàn)選用SNP誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞凋亡，觀察ghrelin預(yù)處理對(duì)SNP損傷3個(gè)不同時(shí)點(diǎn)(12、18和24 h)的抗凋亡效果。然后以HSP70表達(dá)作為指標(biāo)，觀察不同劑量ghrelin上調(diào)HSP70表達(dá)的作用效果，結(jié)果表明ghrelin在SNP損傷后18 h 可顯著上調(diào)HSP70表達(dá)，并明顯抑制SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。根據(jù)量-效和時(shí)-效實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定采用SNP損傷后18 h和100 nmol/L ghrelin進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

HSP70是一種胞漿伴侶蛋白，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊、降解、復(fù)雜組裝和易位。近年來(lái)，HSP70誘導(dǎo)的藥理學(xué)復(fù)合物在減輕細(xì)胞死亡和炎癥，保護(hù)神經(jīng)免受損傷方面具有明顯的臨床意義[19]。本實(shí)驗(yàn)采用HSP70阻斷劑quercetin研究證明，阻斷HSP70可明顯削減ghrelin預(yù)處理對(duì)SNP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用，說(shuō)明HSP70是介導(dǎo)ghrelin神經(jīng)保護(hù)作用的重要分子。但是ghrelin 上調(diào)HSP70高表達(dá)的分子機(jī)制還不全清楚。研究資料表明，ghrelin可能通過(guò)受體后多條信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。Ghrelin抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)元凋亡機(jī)制與MAPK、PI3K、PKC和PKA通路都有一定關(guān)聯(lián)[20]。在鏈脲佐菌素引起的糖尿病腦病大鼠模型中，ghrelin可通過(guò)ERK1/2通路減輕神經(jīng)元損傷并改善學(xué)習(xí)記憶水平[21]。本研究首先觀察了ERK1/2通路與ghrelin上調(diào)HSP70表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果證明ghrelin在減輕PC12細(xì)胞凋亡的同時(shí)，顯著促進(jìn)ERK1/2的磷酸化； 使用抑制劑阻斷ERK1/2信號(hào)通路可則顯著削弱ghrelin對(duì)HSP70表達(dá)的上調(diào)作用，說(shuō)明ghrelin受體后的ERK1/2信號(hào)通路參與介導(dǎo)ghrelin上調(diào)HSP70表達(dá)的作用機(jī)制。至于ghrelin受體后其它信號(hào)通路是否也參與SNP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中HSP70上調(diào)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有待今后繼續(xù)探究。