余 亮， 江惠麗， 劉豪杰， 韓 瑋

(1 鄂州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科， 湖北 鄂州 436000； 2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 安徽 合肥 230000)

褐藻多糖硫酸酯(fucoidan sulfate)又稱為褐藻糖膠、巖藻聚糖，為存在于多種藻類的細(xì)胞間多糖，為一種水溶性雜多糖，主要成分有巖藻糖和硫酸根及木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、Na+、K+和Mg2+等[1-2]。大量研究已證實(shí)，褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂血糖、保護(hù)腎臟、抗病毒、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)及調(diào)節(jié)免疫的活性[3-5]。褐藻多糖硫酸酯在胃癌中的治療作用早已有相關(guān)報(bào)道[6]，但其具體的作用機(jī)制尚未十分清楚。組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylases，HDACs)調(diào)控組蛋白和非組蛋白的去乙?；?jīng)典的HDACs包含HDAC1～HDAC11的成員，對(duì)于細(xì)胞增殖、分化和凋亡至關(guān)重要[7]。HDACs的異常表達(dá)或激活常出現(xiàn)在各種惡性腫瘤中，包括口腔鱗癌、前列腺癌和胃癌[8-10]。HDACs抑制劑可以誘導(dǎo)體內(nèi)外的抗腫瘤作用[11]。大量研究報(bào)道，HDAC1在胃癌中具有重要作用，但其與褐藻多糖硫酸酯的作用關(guān)系尚未清楚。本研究以人胃癌細(xì)胞BGC-823為研究對(duì)象，觀察褐藻多糖硫酸酯及敲減和過(guò)表達(dá)HDAC1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，揭示其機(jī)制可能與褐藻多糖硫酸酯下調(diào)HDAC1有關(guān)，將為褐藻多糖硫酸酯治療胃癌提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT和胰蛋白酶均購(gòu)自GIBCO；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；PVDF膜購(gòu)自Roche；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞BGC-823，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中每2～3 d更換一次培養(yǎng)液。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)接種在6孔細(xì)胞板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合度約為75% 時(shí)，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書操作步驟操作，將si-HDAC1、si-NC、pcDNA 3.1-HDAC1和pcDNA 3.1分別轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基，除si-HDAC1組和si-NC組外，其余各組的細(xì)胞給予褐藻多糖硫酸酯0.6 g/L共培養(yǎng)24 h，分別標(biāo)記為si-HDAC1組、si-NC組、fucoidan+pcDNA 3.1-HDAC1組和fucoidan+pcDNA 3.1組，收集各個(gè)組細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 按照2.2分組取適量各組細(xì)胞，加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)3.5 h，然后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)值。細(xì)胞的活力與吸光度值成正比。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照2.2分組將各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用結(jié)合緩沖液 500 μL 懸浮細(xì)胞，分別加入5 μL的 Annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定結(jié)果。細(xì)胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 按照2.2分組取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，遵照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書要求操作提取RNA，進(jìn)行定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書操作合成cDNA。最后按RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行HDAC1的mRNA檢測(cè)。用2-ΔΔCt計(jì)算HDAC1的mRNA表達(dá)水平。HDAC1的上游引物序列為 5′-CGCATGACTCATAAT-3′，下游引物序列為5′-GCTGTGGTACTTGGTCATCT-3′；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3′，下游引物序列為5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。

2.6 Western blot檢測(cè) 按照2.2分組取適量各組細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4 ℃過(guò)夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4 ℃孵育2 h。加發(fā)光液，曝光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度的褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響

將胃癌細(xì)胞BGC-823培養(yǎng)24 h后，用MTT法檢測(cè)褐藻多糖硫酸酯(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L)對(duì)BGC-823細(xì)胞活力的抑制率，結(jié)果顯示，與0 g/L組相比，0.2 g/L組、0.4 g/L組、0.6 g/L組、0.8 g/L組和1.0 g/L組的抑制率均顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。選用抑制率為50%左右的褐藻多糖硫酸酯濃度(0.6 g/L)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

2 褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)褐藻多糖硫酸酯處理過(guò)的胃癌細(xì)胞的凋亡率，與control組相比，fucoidan組細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖2。

Figure 1. The effect of fucoidan sulfate on the inhibitory rate of the viability of the gastric cancer BGC-823 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 g/L group.

圖1 褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞抑制率的影響

3 褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與control組相比，fucoidan組胃癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05),見圖3。

4 褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞中HDAC1表達(dá)的影響

運(yùn)用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞中HDAC1的表達(dá)，與control組相比，fucoidan組細(xì)胞中HDAC1的mRNA表達(dá)水平顯著降低，HDAC1蛋白表達(dá)也顯著降低(P<0.05),見圖4。

Figure 2. The effect of fucoidan sulfate on apoptosis of gastric cancer BGC-823 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3. The effect of fucoidan sulfate on the apoptosis-related protein expression in gastric cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. The effect of fucoidan sulfate on the expression of HDAC1 in the gastric cancer BGC-823 cells. A :the mRNA expression of HDAC1; B: the protein expression of HDAC1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞中HDAC1表達(dá)的影響

5 敲減胃癌細(xì)胞HDAC1的表達(dá)

將si-HDAC1和si-NC轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞，與si-NC組細(xì)胞相比，si-HDAC1組細(xì)胞中HDAC1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. Knock-down ofHDAC1expression in the gastric cancer BGC-823 cells. A: the mRNA expression of HDAC1; B: the protein expression of HDAC1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

圖5 敲減胃癌細(xì)胞HDAC1的表達(dá)

6 敲減HDAC1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞活力和凋亡的影響

與si-NC組相比，si-HDAC1組細(xì)胞活力在48和72 h時(shí)顯著降低(P<0.05)，見圖6A，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖6B。

Figure 6. The effect ofHDAC1expression knock-down on the viability and apoptosis of the gastric cancer BGC-823 cells. A: the changes of the cell viability; B: the changes of the apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

圖6 敲減HDAC1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞活性和凋亡的影響

7 過(guò)表達(dá)HDAC1逆轉(zhuǎn)了褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞活力的抑制和凋亡的促進(jìn)作用

與control組相比，fucoidan組細(xì)胞中HDAC1的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與fucoidan+pcDNA 3.1組相比，fucoidan+pcDNA 3.1-HDAC1組細(xì)胞中的HDAC1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖7。

討 論

大量研究表明，褐藻多糖硫酸酯具有抗炎、抗氧化、抗凝血、抗免疫缺陷和抗腫瘤等多種生物活性[12-14]。值得注意的是褐藻多糖硫酸酯在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌和白血病等多種腫瘤的治療中具有較高的療效[15]。Park等[16]發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯通過(guò)誘導(dǎo)自噬和凋亡能有效地抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制與抗凋亡Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)的下調(diào)，線粒體膜電位的喪失，半胱天冬酶的激活以及多聚(ADP-核糖)聚合酶蛋白的伴隨降解和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化和增加beclin-1的積累相關(guān)，表明褐藻多糖硫酸酯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬細(xì)胞死亡，凋亡和自噬機(jī)制都有助于褐藻多糖硫酸酯誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞死亡。Yoshimoto等[17]發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞MKN45中褐藻多糖硫酸酯可下調(diào)磷酸化ASK1水平，失活A(yù)SK1-p38信號(hào)通路，從而抑制MKN45細(xì)胞增殖及DNA合成。本研究檢測(cè)了褐藻多糖硫酸酯(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L)處理的BGC-823細(xì)胞的抑制率發(fā)現(xiàn)，褐藻多糖硫酸酯對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制率呈濃度依賴性遞增，且最適濃度為0.6 g/L；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)褐藻多糖硫酸酯處理的BGC-823細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，褐藻多糖硫酸酯可上調(diào)BGC-823細(xì)胞的凋亡率，下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax表達(dá)；深入研究發(fā)現(xiàn)，褐藻多糖硫酸酯可下調(diào)BGC-823細(xì)胞中HDAC1的表達(dá)，推測(cè)褐藻多糖硫酸酯的作用機(jī)制可能與抑制HDAC1表達(dá)相關(guān)。這是國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)的褐藻多糖硫酸酯的功能機(jī)制。

Figure 7. Over-expression of HDAC1 reversed the inhibition of cell viability and the promotion of apoptosis in the gastric cancer BGC-823 cells induced by fucoidan sulfate. A: the changes of HDAC1 protein level; B: the changes of the cell viability; C: the changes of the apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsfucoidan+pcDNA 3.1 group.

圖7 過(guò)表達(dá)HDAC1逆轉(zhuǎn)了褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞活性的抑制和凋亡的促進(jìn)作用

在過(guò)去的幾十年中的研究顯示，表觀遺傳異?？赡苁悄[瘤的標(biāo)志之一。例如，組蛋白的翻譯后修飾可能通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，染色質(zhì)重塑和核結(jié)構(gòu)在腫瘤發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。組蛋白乙?；且豁?xiàng)研究良好的翻譯后組蛋白修飾，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白脫乙酰酶(HDACs)的相反活性控制[19]。通過(guò)去除乙酰基，HDAC逆轉(zhuǎn)染色質(zhì)乙酰化并改變癌基因和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄[20]。此外，HDAC使許多非組蛋白細(xì)胞底物脫乙酰化，這些底物控制著廣泛的生物過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[21]。早在2001年，Choi等[22]在胃癌的研究中已證實(shí)，HDAC1在胃癌組織中過(guò)度表達(dá)，且大多定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核。Nakagawa等[23]闡明，HDAC1、2、3和8組成的I類HDAC在人類的幾種腫瘤及癌細(xì)胞中高表達(dá)，包括胃癌、食道癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳房癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌和甲狀腺癌，表明了HDAC抑制劑可用于治療人類的多種腫瘤。Cao等[24]在胃腸道惡性腫瘤的研究中闡明，HDAC1在胃腸道惡性腫瘤中的表達(dá)水平，特別是在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯高于非癌組織，且其與腫瘤分期及分級(jí)顯著正相關(guān)，與患者總體存活率呈負(fù)相關(guān)，提示HDAC1可以作為胃腸道惡性腫瘤的良好診斷和預(yù)后標(biāo)志物。本研究檢測(cè)敲減HDAC1表達(dá)的胃癌細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲減HDAC1表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡；過(guò)表達(dá)HDAC1可逆轉(zhuǎn)褐藻多糖硫酸酯對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

綜上所述，褐藻多糖硫酸酯可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與褐藻多糖硫酸酯負(fù)向調(diào)控HDAC1有關(guān)。本研究結(jié)果為褐藻多糖硫酸酯用于胃癌的預(yù)防和治療提供了依據(jù)。