肖 慶， 劉 莉， 胡雅君， 姜 柳， 李金麗， 鄧小艷

(武漢市第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科， 湖北 武漢 430030)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)是常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，好發(fā)于絕經(jīng)期和絕經(jīng)后的女性，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是世界第6大婦科惡性腫瘤[1]。據(jù)報(bào)道，2012年世界子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例約32萬(wàn)，死亡約7萬(wàn)例，其中發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率較高[2]。子宮內(nèi)膜癌早期癥狀明顯，經(jīng)確診時(shí)多數(shù)患者病灶局限于子宮內(nèi)，且生長(zhǎng)緩慢，發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)間較晚，及早發(fā)現(xiàn)并治療患者預(yù)后較好，5年生存率高達(dá)80%[3]；而晚期子宮內(nèi)膜癌約占25%，治療難度大，雖然手術(shù)治療、放療和化療等聯(lián)合進(jìn)行能夠在延緩疾病發(fā)展，但預(yù)后較差[4]。白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)是主要由輔助性T細(xì)胞分泌的促炎因子，與自身免疫性疾病、傳染性疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-6]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，IL-17在胃癌和肝癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[7-8]。本研究以人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞為研究對(duì)象，給予IL-17外源性處理，通過(guò)MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-17對(duì)HEC-1-B細(xì)胞活力、遷移和侵襲的影響。

材 料 和 方 法

1 一般資料

選取2016年1月～2018年3月就診于武漢市第一醫(yī)院的子宮內(nèi)膜癌患者和良性子宮病變患者為研究對(duì)象：子宮內(nèi)膜癌36例，年齡42～78歲，均行子宮切除術(shù)，術(shù)前未接受放、化療，記為cancer組；良性子宮病變患者36例，年齡33～76歲，記為良性(benign)組。2組患者術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

2 材料

人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。胎牛血清、DMEM和胰蛋白酶購(gòu)自HyClone；TRIzol總RNA提取試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、control mimics和miR-195-5p mimics購(gòu)自Invitrogen；Transwell小室購(gòu)自Corning；MTT和二甲基亞砜購(gòu)自Sigma；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa；結(jié)晶紫和多聚甲醛購(gòu)自Solarbio；引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成。NanoDrop微量核酸測(cè)定儀購(gòu)自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo；HBS-1096B型酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；顯微鏡購(gòu)自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEC-1-B細(xì)胞，每隔2～3 d換液1次；0.25% 胰蛋白酶消化后傳代。將HEC-1-B細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約50%， 按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別將control mimics和miR-195-5p mimics分別轉(zhuǎn)染至HEC-1-B細(xì)胞，并標(biāo)記為miR-con組和miR-195-5p組。另取適量HEC-1-B細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照(control)組和不同濃度IL-17干預(yù)組。Control組：細(xì)胞未做任何處理；不同濃度IL-17干預(yù)組：在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-17并調(diào)整終濃度分別為1、10、100 和 300 μg/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于總RNA提取。

3.2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取適量人子宮內(nèi)膜癌組織和良性子宮病變組織及各組細(xì)胞，充分研磨，采用TRIzol法提取總RNA，NanoDrop微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析方法采用2-ΔΔCt法。IL-17的上游引物序列為5′-ACCCCTCGGAAGTTGTAC-3′，下游引物序列為5′-CAGTCACCAGCACCTTC-3′；miR-195-5p的上游引物序列為5′-GATAGCAG CACAGAAATATTGGG-3′，下游引物序列為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；β-actin的上游引物序列為5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物序列為5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取HEC-1-B細(xì)胞隨機(jī)分為IL-17組、 IL-17+miR-con組和IL-17+miR-195-5p組。IL-17組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-17并調(diào)整終濃度為100 μg/L；IL-17+miR-con組在轉(zhuǎn)染control mimics的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-17并調(diào)整終濃度為100 μg/L；IL-17+miR-195-5p組在轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-17并調(diào)整終濃度為100 μg/L。上述細(xì)胞及control組、miR-con組和miR-195-5p組的細(xì)胞在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)加入20 μL濃度為5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL二甲基亞砜振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值。

3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 收集control組、IL-17組、miR-con組、miR-195-5p組、 IL-17+miR-con組和IL-17+miR-195-5p組細(xì)胞，胰酶消化后使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為2×107/L。取200 μL 細(xì)胞懸液分別接種于包被和未包被基質(zhì)膠的小室并置于含完全培養(yǎng)基的下室中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，加入4% 多聚甲醛固定30 min，0.1% 結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照，計(jì)算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為穿膜細(xì)胞數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)比較經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 子宮內(nèi)膜癌組織中IL-17和miR-195-5p的表達(dá)

采用RT-qPCR法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中IL-17和miR-195-5p的表達(dá)，結(jié)果表明，與benign組相比，cancer組中IL-17的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05), miR-195-5p的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The expression level of IL-17 mRNA and miR-195-5p in the endometrial cancer tissues. Mean±SD.n=36.*P<0.05vsbenign group.

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織中IL-17 mRNA和miR-195-5p的表達(dá)

2 IL-17抑制HEC-1-B細(xì)胞中miR-195-5p的表達(dá)

以不同濃度IL-17干預(yù)HEC-1-B細(xì)胞48 h，RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-195-5p表達(dá)。如圖2所示，10、100和300 μg/L的IL-17能顯著抑制HEC-1-B細(xì)胞中miR-195-5p表達(dá)(P<0.05)，且濃度越高，抑制作用越明顯，100和300 μg/L的IL-17干預(yù)后miR-195-5p表達(dá)水平無(wú)明顯差異，因此選用100 μg/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 2. IL-17 inhibited miR-195-5p expression in the HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs10 μg/L group.

圖2 IL-17抑制HEC-1-B細(xì)胞中miR-195-5p表達(dá)

3 IL-17增強(qiáng)HEC-1-B細(xì)胞的活力

使用100 μg/L IL-17干預(yù)HEC-1-B細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示， IL-17組的細(xì)胞活力顯著高于control組(P<0.05)，且呈時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖3。

Figure 3. IL-17 increased the viability of HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 IL-17增強(qiáng)HEC-1-B細(xì)胞的活力

4 IL-17促進(jìn)HEC-1-B細(xì)胞的遷移和侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEC-1-B細(xì)胞的遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)IL-17組的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)較control組顯著增多(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5 過(guò)表達(dá)miR-195-5p抑制HEC-1-B細(xì)胞的活力、遷移和侵襲

將miR-195-5p mimics轉(zhuǎn)染至HEC-1-B細(xì)胞后，細(xì)胞的活力較miR-con組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5A；視野內(nèi)遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于miR-con組(P<0.05),見(jiàn)圖5B、C。

Figure 4. IL-17 promoted migration (A) and invasion (B) abilites of the HEC-1-B cells (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 IL-17促進(jìn)HEC-1-B細(xì)胞的遷移和侵襲能力

Figure 5. Over-expression of miR-195-5p inhibited the viability (A), migration (B) and invasion (C) of the HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-con group.

圖5 過(guò)表達(dá)miR-195-5p抑制HEC-1-B細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力

6 過(guò)表達(dá)miR-195-5p可減弱IL-17對(duì)HEC-1-B細(xì)胞活力、侵襲和遷移的促進(jìn)作用

MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，使用100 μg/L IL-17干預(yù)HEC-1-B細(xì)胞后，細(xì)胞活力增強(qiáng)(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；而將miR-195-5p mimics轉(zhuǎn)染至HEC-1-B細(xì)胞并聯(lián)合100 μg/L IL-17干預(yù)后，細(xì)胞的活力有所下降(P<0.05)，視野內(nèi)遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于IL-17+miR-con組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

在我國(guó)，每年約有5萬(wàn)子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例，死亡例數(shù)約1.8萬(wàn)，其發(fā)病率高居我國(guó)女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位，并且趨于年輕化[9]。研究表明，肥胖、糖尿病和激素類(lèi)藥物治療等是子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)因素，采用影像學(xué)檢查、血清腫瘤標(biāo)志物檢查、組織病理學(xué)檢查等早期篩查方法有助于子宮內(nèi)膜癌的明確診斷[10]。

白細(xì)胞介素(interleukins, ILs)是一類(lèi)在免疫細(xì)胞增殖、活化和免疫應(yīng)答等生物過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，其家族成員眾多，且不同分子可交叉聯(lián)系。隨著研究的深入，ILs已被證實(shí)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、抑郁癥、器官纖維化、癌癥等疾病中發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，并且已有多種以ILs為靶點(diǎn)的藥物已被批準(zhǔn)上市[11-12]，其中，IL-17可由輔助性T細(xì)胞17、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，由6個(gè)亞型組成。據(jù)報(bào)道，IL-17在惡性腫瘤進(jìn)程中具有雙重作用：既能夠通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成加劇腫瘤惡化，又能夠通過(guò)增強(qiáng)免疫細(xì)胞清除能力抑制腫瘤發(fā)展[13-15]。Wei 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能夠通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2，促進(jìn)小鼠體內(nèi)非小細(xì)胞肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移；并且IL-17在乳腺癌組織中高表達(dá)，在乳腺癌小鼠模型中進(jìn)行IL-17靜脈注射能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[17]；而Tong等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可抑制結(jié)直腸癌血管生成從而發(fā)揮抑癌作用。此外，已有證據(jù)表明，IL-17在人子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)[19]。 本文采用RT-qPCR法檢測(cè)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，IL-17在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，使用外源性IL-17干預(yù)HEC-1-B細(xì)胞能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的活力、遷移和侵襲。

Figure 6. Over-expression of miR-195-5p attenuated the promoting effect of IL-17 on the viability (A), migration (B) and invasion (C) of the HEC-1-B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIL-17+miR-con group.

圖6 過(guò)表達(dá)miR-195-5p可減弱IL-17對(duì)HEC-1-B細(xì)胞的活力、侵襲和遷移的促進(jìn)作用

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類(lèi)廣泛存在于生物細(xì)胞中的一類(lèi)小分子單鏈RNA分子，其本身不編碼蛋白，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、脂類(lèi)代謝和個(gè)體形態(tài)形成等一系列生命活動(dòng)。越來(lái)越多的證據(jù)[20]表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥等相關(guān)研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。miR-195位于人17號(hào)染色體，在乳腺癌和前列腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)異常，其表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移、病情分級(jí)和患者預(yù)后等有關(guān)[21-22]。Zhen 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-195可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞的活力；Li 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-195在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-195可通過(guò)調(diào)節(jié)β連環(huán)蛋白抑制細(xì)胞的活力、遷移和侵襲，是結(jié)腸癌診斷的標(biāo)志物。此外，有證據(jù)表明,miR-195-5p在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-195-5p對(duì)癌細(xì)胞的活力、遷移能力和侵襲能力具有抑制作用[25]。本研究結(jié)果顯示，miR-195-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)；使用外源性IL-17干預(yù)HEC-1-B細(xì)胞后，miR-195-5p表達(dá)水平顯著降低。在HEC-1-B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-195-5p能有效抑制細(xì)胞活力、遷移和侵襲，并減弱外源性IL-17對(duì)HEC-1-B細(xì)胞活力、侵襲和遷移的促進(jìn)作用。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜癌組織中，IL-17高表達(dá)而miR-195-5p低表達(dá)；外源性IL-17干預(yù)可抑制HEC-1-B細(xì)胞中miR-195-5p表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞活力、遷移和侵襲。IL-17和miR-195-5p可能是子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)志物和靶向治療的新靶點(diǎn)。