柴松波， 王振濤， 張淑娟， 劉舜禹

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/河南省中醫(yī)院心病科， 河南 鄭州 450002)

心力衰竭為各種心臟疾病的終末階段，是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的重要原因之一，給患者家庭帶來巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。心力衰竭發(fā)生發(fā)展機制較復(fù)雜[1]，目前尚無統(tǒng)一定論。近期研究顯示自噬在心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用；關(guān)于心肌梗死的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)自噬能夠造成心肌細(xì)胞數(shù)量減少，引發(fā)心室壁厚度降低，心腔擴大，從而加重慢性心力衰竭的發(fā)展[2]。心衰康主要由黃芪、桂枝、赤芍和丹參等組成，具有溫經(jīng)通脈、補脾益肺和活血利水的功效[3]。臨床研究顯示，心衰康對慢性心衰患者的治療效果較好，可改善心功能，降低心衰的反復(fù)發(fā)作，提高患者生活質(zhì)量。然而心衰康的具體作用機制目前尚不明確[4]。本研究通過復(fù)制慢性心力衰竭大鼠模型，給予心衰康治療，以探究心衰康對慢性心力衰竭大鼠心肌的保護(hù)作用并初步探究其可能的作用機制，以期為慢性心力衰竭的臨床治療提供一定的參考。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

雄性Wistar大鼠，體重200～220 g， 8周齡，SPF清潔級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物使用許可證號為SYXK(豫)2015-0005，嚴(yán)格遵循動物飼養(yǎng)規(guī)則進(jìn)行統(tǒng)一喂養(yǎng)，實驗期間大鼠自由飲水、攝食，1 周后用于模型制備。

2 實驗藥物

心衰康顆粒為三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥免煎顆粒，經(jīng)河南省中醫(yī)院中藥房鑒定，由附子、紅參、丹參、黃芪、紅花和桂枝組成(批號為170526)，使用時溶于蒸餾水；卡托普利(captopril)由湖南漢森制藥股份有限公司生產(chǎn)(批號為20170618)。

3 試劑及儀器

HE染色試劑盒(生工生物公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和TTC染料(碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白裂解液、蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)、p-p38 MAPK和β-actin抗體(Abcam)；抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtube-associated protein 1 light chain 3，LC3)、beclin-1和p62抗體及HRP標(biāo)記山羊抗兔II抗(CST)。S80彩色多普勒超聲診斷儀(SIEMENS，探頭頻率為3.5 MHz)；垂直電泳儀和蛋白凝膠成像儀(Bio-Rad)；熒光顯微鏡(Olympus)。

4 方法

4.1 慢性心力衰竭大鼠模型的制備[5]造模前對所有大鼠進(jìn)行心臟超聲檢測，確保所有大鼠心功能正常。腹腔注射水合氯醛(7 mL/kg)麻醉大鼠，氣管插管連接小動物呼吸機，于左胸第3～4肋骨間切開皮膚，分離肌層打開胸腔，將心包剪開后，用6-0絲線于左心耳和動脈圓錐下方2 mm處結(jié)扎冠狀動脈，隨后將心臟重新納入胸腔，縫合切口，待大鼠自由呼吸后撤掉呼吸機，每天注射40萬單位青霉素，連用3 d。假手術(shù)(sham)組大鼠開胸后僅進(jìn)行穿線，不結(jié)扎冠狀動脈。術(shù)后4周，進(jìn)行心臟彩超檢測，以左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)<45%視為慢性心力衰竭大鼠模型制備成功。排除死亡和感染大鼠，共60只大鼠模型制備成功，假手術(shù)組大鼠12只。

4.2 動物分組與給藥 模型制備后將大鼠分為模型(model)組、心衰康低、中和高劑量(low-, middle-and high-dose Xinshuaikang treatment, TL、TM和TH)組及卡托普利(陽性，captopril)組，每組均12只大鼠。TL、TM和TH組：于模型制備后4周，每只分別予以12、20和40 mg/kg心衰康顆粒灌胃[6]；Captopril組：于模型制備后4周，予以10 mg/kg卡托普利灌胃[7]；Sham和model組：于模型制備后4周，分別予以等量生理鹽水灌胃；各組均每天處理1次，連續(xù)處理8周。

4.3 彩色多普勒超聲儀檢測大鼠心室功能 末次給藥后，對大鼠充分麻醉后，使其仰臥固定在鼠板上，采用彩色多普勒超聲儀，調(diào)節(jié)至二維模式，檢測各組左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)、LVEF、舒張末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-diastole,LVPWTd)和收縮末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-systole, LVPWTs)并記錄，連續(xù)檢測3個心臟周期求得平均值。隨后行右頸總動脈插管，將導(dǎo)管從右頸總動脈插入，逆向進(jìn)入左心室，末端連接血壓換能器，測定左心室壓力最大上升/下降速率(maximum rate of rise/decrease of left ventricular pressure, +dp/dtmax/-dp/dtmax)、左心室舒張壓(left ventricular diastolic pressure，LVDP)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressuer，LVSP)和心輸出量(cardiac output, CO)，連續(xù)檢測3次取平均值。

4.4 TTC染色評估大鼠梗死體積 超聲檢測結(jié)束后，每組隨機選取6只大鼠充分麻醉后，頸總動脈逆行注射0.5%伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)1 mL，隨后迅速處死大鼠獲取心臟，-20 ℃過夜保存。沿左心室橫向?qū)⒆笮氖仪袨?片，添加1% TTC溶液室溫孵育20 min；隨后放置于10%甲醛溶液中固定。染色后藍(lán)色部分代表正常心肌組織，紅色部分代表缺血危險組織，白色部分代表梗死組織。拍照保存，采用Image-Pro Plus軟件定量分析各組大鼠心肌組織切片梗死體積，計算心肌梗死體積比例。

4.5 樣本采集 將各組剩余大鼠處死后收集心臟，清洗后，摘除非心肌組織后將一部分心肌組織置于4%多聚甲醛固定過夜，以制備石蠟切片；另一部分置于-80 ℃保存。

4.6 HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)的改變 取出固定心肌組織，常規(guī)制備石蠟切片(5 μm)，經(jīng)烘烤、二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水后，采用HE染色試劑盒對心肌組織石蠟切片進(jìn)行染色，樹脂封片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理損傷情況。

4.7 TUNEL實驗檢測心肌細(xì)胞凋亡 常規(guī)制備心肌冷凍切片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書對切片進(jìn)行染色，其中采用抗心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)抗體染色心肌細(xì)胞，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色心肌細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，拍照保存，采用ImageJ軟件對心肌細(xì)胞陽性率進(jìn)行定量分析，細(xì)胞凋亡率(%)=陽性染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

4.8 熒光顯微鏡檢測心肌細(xì)胞自噬 取出固定心肌組織，添加Triton X-100透化組織20 min，水洗后加入熒光染液，37 ℃避光孵育20 min，封閉后添加LC3熒光 I 抗(1100)，4 ℃避光孵育過夜，PBS清洗后加入熒光 II 抗，室溫孵育2 h，清洗后置于熒光顯微鏡中觀察蛋白陽性表達(dá)情況。

4.9 Western blot法分析蛋白水平 于液氮中研磨凍存心肌組織，后添加裂解液提取組織總蛋白，行SDS-PAGE分離等量蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，5%脫脂奶粉封閉后添加抗p-ERK、p-p38MAPK、LC3-II、beclin-1、p62和β-actin抗體(1 500)，4 ℃過夜孵育，添加 II 抗(15 000)后室溫下放置1 h，用ECL發(fā)光顯影后置于凝膠成像儀內(nèi)觀察各蛋白表達(dá)，采用ImageJ軟件對各蛋白條帶進(jìn)行量化分析。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間對比采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心衰康對心衰大鼠心室功能的影響

與sham組相比，model組的LVEDD和LVESD升高，LVPWTd、LVPWTs和LVEF降低(P<0.05);與model組相比，心衰康各組與卡托普利組的LVEDD和LVESD均降低，LVPWTd、LVPWTs和LVEF升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心室功能相關(guān)指標(biāo)的比較

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

2 心衰康對心衰大鼠血流動力學(xué)的影響

與sham組相比，model組的CO、LVSP、LVDP、 +dp/dtmax和-dp/dtmax均降低(P<0.05)；與model組相比，心衰康各組與卡托普利組的CO、LVSP、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血流動力學(xué)變化情況的比較

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

3 各組大鼠心肌梗死情況

與sham組相比，model組心肌梗死體積顯著升高(P<0.05);與model組相比，心衰康各組與卡托普利組心肌梗死體積顯著降低(P<0.05)，見表3。

4 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化

Sham組心肌細(xì)胞形態(tài)大小正常,細(xì)胞器分布均勻，結(jié)構(gòu)正常,心肌纖維排列規(guī)則，未見病理性損傷；Model組可見心肌細(xì)胞變形，出現(xiàn)空泡，部分細(xì)胞壞死，心肌纖維排列不規(guī)則，出現(xiàn)斷裂，細(xì)胞間伴有炎性細(xì)胞浸潤；心衰康各組與卡托普利組的心肌細(xì)胞水腫和壞死減少，細(xì)胞纖維形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞浸潤明顯降低，見圖1。

5 各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況

TUNEL實驗結(jié)果顯示，與sham組相比，model組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與model組相比，心衰康各組與卡托普利組的心肌細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05)，見圖2、表3。

6 各組大鼠心肌組織自噬情況的比較

與sham組相比，model組的LC3-II陽性率顯著升高(P<0.05);與model組相比，心衰康各組與卡托普利組心肌細(xì)胞的LC3-II陽性率均降低(P<0.05)，見圖3、表3。

Figure 1. Histopathological changes of myocardium in the rats were observed by HE staining.

圖1 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化

Figure 2. Apoptosis of cardiomyocyte in rats was observated by TUNEL.

圖2 TUNEL法觀察大鼠心肌細(xì)胞凋亡

表3 各組大鼠心肌梗死體積比、心肌細(xì)胞凋亡率及自噬情況(LC3-II陽性率)的比較

Table 3. The changes of TTC staining for evaluating myocardial infarction volume， the apoptotic rate (by TUNEL) and autophagy (by LC3-II immunofluorescene labeling) in the myocardium of the rats with different treatments (Mean±SD.n=6)

GroupInfarcted/total volume (%)Apoptotic rate (%)LC3-II positive rate (%)Sham 6.35±0.3110.73±2.069.51±0.07Model39.86±5.24*42.26±4.58*62.08±7.41*TL32.31±4.42*#34.13±4.16*#45.72±8.37*#TM24.05±4.73*#25.86±3.24*#34.35±4.27*#TH21.27±4.08*#19.47±2.32*#28.66±2.53*#Captopril20.45±5.32*#18.36±2.46*#25.64±3.14*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

Figure 3. Autophagy of cardiac myocytes was obervated by immunofluorescence. The scale bar=2 μm.

圖3 免疫熒光法觀察心肌細(xì)胞自噬情況

7 心衰康對心衰大鼠MAPK/ERK1/2通路的影響

與sham組相比，model組的ERK和p38 MAPK蛋白磷酸化水平均升高(P<0.05)；與model組相比，心衰康各組與卡托普利組的ERK和p38 MAPK蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。見圖4A、表4。

8 心衰康對心衰大鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與sham組相比，model組的LC3-II/LC3-I比值和beclin-1蛋白表達(dá)水平升高，p62 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與model組相比，心衰康各組與卡托普利組的LC3-II/LC3-I比值和beclin-1蛋白表達(dá)水平均降低，p62 蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖4B、表5。

討 論

目前常用阿奇霉素法、腹動脈收縮法和冠狀動脈結(jié)扎法制備動物心衰模型，研究顯示結(jié)扎左冠狀動脈前降支能夠造成動物慢性心力衰竭，其病理生理變化以及心室功能變化與臨床心力衰竭相似[8]。心力衰竭一般表現(xiàn)為心肌收縮功能障礙，射血能力下降[9]。本研究通過采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備心力衰竭大鼠模型，超聲檢測發(fā)現(xiàn)與sham組相比，model組大鼠的LVEDD和LVESD升高，LVPWTd、LVPWTs和LVEF降低，CO、LVSP、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，表明模型大鼠心輸出量、收縮能力以及射血能力均顯著降低，病理檢測發(fā)現(xiàn)model組大鼠心肌細(xì)胞變形、壞死,心肌纖維斷裂，伴有炎性細(xì)胞浸潤，表明model組大鼠心肌組織出現(xiàn)炎癥性損傷，提示慢性心力衰竭大鼠模型復(fù)制成功。

Figure 4. The representitive images of Western blot for determining the protein levels of p-ERK, p-p38 MAPK (A), LC3, beclin-1 and p62 (B).

圖4 Western blot法檢測各組p-ERK、p-p38 MAPK、LC3、beclin-1和p62的蛋白水平

表4 各組大鼠p-ERK和p-p38MAPK蛋白水平的比較

Table 4. Western blot was used to determine the protein levels of ERK, p-ERK, p38 MAPK and p-p38 MAPK in the myocardium of the rats with different treatments (Mean±SD.n=6)

GroupERKp-ERKp38 MAPKp-p38 MAPKp-ERK/ERKp-p38 MAPK/p38 MAPKSham0.63±0.080.32±0.031.10±0.130.23±0.020.42±0.060.25±0.03Model0.64±0.070.75±0.08*1.08±0.150.64±0.05*1.35±0.07*0.68±0.05*TL0.66±0.080.58±0.07*#1.05±0.120.44±0.06*#1.07±0.07*#0.54±0.06*#TM0.69±0.080.42±0.05*#1.05±0.140.30±0.04*#0.82±0.05*#0.35±0.04*#TH0.63±0.060.37±0.03*#1.04±0.130.26±0.05#0.67±0.03*#0.28±0.05*#Captopril0.64±0.070.32±0.04#1.07±0.090.21±0.03#0.51±0.04*#0.20±0.04*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

表5 各組大鼠LC3、beclin-1和p62蛋白表達(dá)的比較

Table 5. Western blot was used to determine the protein levels of LC3, beclin-1 and p62 in the myocardium of the rats with different treatments (Mean±SD.n=6)

GroupLC3-ILC3-IILC3-II/LC3-IBeclin-1p62Sham0.67±0.040.13±0.030.20±0.030.14±0.130.68±0.05Model0.61±0.080.56±0.05*0.91±0.05*1.22±0.03*0.20±0.03*TL0.62±0.060.48±0.05*#0.69±0.05*#1.06±0.05*#0.33±0.05*#TM0.65±0.070.41±0.06*#0.61±0.06*#0.84±0.09*#0.41±0.04*#TH0.65±0.140.36±0.03*#0.51±0.03*#0.52±0.05*#0.49±0.04*#Captopril0.66±0.170.29±0.04*#0.36±0.04*#0.39±0.03*#0.54±0.05*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

西醫(yī)在治療心力衰竭方面取得較大的進(jìn)展，可有效提高患者生存質(zhì)量，減輕心臟負(fù)擔(dān)、抑制心室重構(gòu)，改善患者的預(yù)后。中醫(yī)治療心力衰竭方面也占據(jù)一定的優(yōu)勢，心衰康為河南省中醫(yī)院著名心血管病專家孫建芝教授擬定用于治療心力衰竭的有效方劑，主要由附子、紅參、丹參、黃芪、紅花和桂枝等組成，具有益氣溫陽和活血化瘀的功效。臨床研究顯示，心衰康顆粒能夠明顯改善心力衰竭患者心功能，提高生活質(zhì)量，且毒副作用較小[10]?；A(chǔ)研究顯示心衰康能夠提高心肌細(xì)胞能量供應(yīng)，抑制大鼠心室重構(gòu)[11]。本研究顯示，與model組相比，心衰康各組大鼠的LVEDD和LVESD降低，LVPTWd、LVPTWs和LVEF升高，CO、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高；心肌細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞浸潤減輕，提示心衰康可改善心衰大鼠心室結(jié)構(gòu)以及心功能，還可抑制心室重構(gòu)，且效果與卡托普利相似，提示心衰康對慢性心力衰竭大鼠具有一定的治療效果，能夠改善心室功能。

心肌組織受損是由多因素共同作用的結(jié)果，與細(xì)胞凋亡有關(guān)。正常情況下細(xì)胞凋亡對維持機體健康是有益的；當(dāng)細(xì)胞受到刺激或損傷后，細(xì)胞凋亡程序發(fā)生紊亂，細(xì)胞發(fā)生異常凋亡，導(dǎo)致組織病理損傷以及細(xì)胞壞死[12]。近期多項研究證實在心肌損傷過程中，除存在凋亡還存在自噬，兩者可能呈協(xié)同作用或拮抗作用保護(hù)/促進(jìn)心肌損傷，目前尚不明確[13]。研究顯示在心力衰竭大鼠中，給予自噬抑制劑干預(yù)后，心肺血流動力學(xué)發(fā)生改善，且線粒體通透性降低，推測自噬可能導(dǎo)致慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[14]。Jensen等[15]研究顯示在擴張性心肌病患者進(jìn)行左心室輔助裝置(left ventricular assist device，LAVD)植入后，自噬蛋白LC3-II表達(dá)降低，患者心室功能得到一定的改善，推測降低心臟自噬水平可提高心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，model組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高；心肌組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-II和beclin-1蛋白表達(dá)升高，p62蛋白表達(dá)降低；給予心衰康干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡率降低，自噬相關(guān)蛋白LC3-II和beclin-1蛋白表達(dá)降低，p62蛋白表達(dá)升高，提示心肌細(xì)胞凋亡和自噬同時參與心肌損傷過程，心衰康可能通過抑制心肌細(xì)胞自噬和凋亡進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

MAPK信號通路與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥和免疫應(yīng)答等病理過程相關(guān)。MAPK信號通路主要包括ERK、p38 MAPK和JNK信號通路，當(dāng)細(xì)胞遭受外界刺激或損傷后，3條信號通路可獨立發(fā)揮作用，也能通過相互交聯(lián)發(fā)揮作用[16]。目前已有研究證實，MAPK信號通路與心衰、心梗梗死和心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[17]。Cipolletta等[18]研究顯示，在心肌肥厚大鼠中p-ERK表達(dá)明顯升高，而抑制p-ERK表達(dá)后可降低心臟體積、心肌壁厚度和左心室質(zhì)量，緩解心肌肥厚病情進(jìn)展。另有實驗研究顯示，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cells，EnSCs)來源的細(xì)胞因子"雞尾酒"(EnSC-derived cytokine cocktail，EdCC)通過激活MEK1/ERK1/2信號通路能夠有效減輕心肌缺血再灌注損傷，因此推測EdCC可保護(hù)小鼠心肌缺血再灌注損傷，而MEK1-ERK信號通路是關(guān)鍵機制，同時也是保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的重要信號通路[19]。心肌缺血再灌注損傷可激活STAT3/ERK1/2通路，能夠提高心肌細(xì)胞自噬水平，加重心肌損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，model組p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白水平較sham組均升高，給予心衰康后p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白水平均降低，提示心衰康可能通過抑制MAPK/ERK1/2信號通路，降低心肌自噬活性，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，心衰康能夠抑制MAPK/ERK1/2通路，進(jìn)而降低心肌自噬水平，減輕心肌組織損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)功能，然而MAPK/ERK1/2通路調(diào)控機制較復(fù)雜，涉及上、下游調(diào)控蛋白較多，關(guān)于心衰康是通過哪些基因來調(diào)控MAPK/ERK1/2通路還有待后續(xù)深入研究。