陳圣菊，尚畫雨，白勝超，張 荷，張俊芬，邱平學(xué)，周 越

相關(guān)報(bào)告顯示，當(dāng)前全球有2億肥胖患者，而中國肥胖人口已達(dá)6 200萬，居全球第二，增速為全球之最[1]。肥胖個(gè)體通常伴有脂肪組織的炎性介質(zhì)分泌增加和局部缺氧[2]。隨著肥胖的發(fā)展，脂肪細(xì)胞體積變大(主要集中于腹部和睪周)，功能紊亂，出現(xiàn)胰島素抵抗(insulin rsistance，IR)等多種病理特征[3]。其中由脂肪組織分泌的炎癥因子導(dǎo)致的慢性炎癥是肥胖和胰島素抵抗的關(guān)鍵連接機(jī)制，這種慢性炎癥反應(yīng)是IR發(fā)生的重要因素，但目前肥胖引起IR形成的具體分子機(jī)制尚未明確。缺氧是脂肪組織功能紊亂的一個(gè)重要原因。低氧誘導(dǎo)因子 -1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的激活是低氧應(yīng)答的主要機(jī)制，其α亞基對氧比較敏感，通過轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與β亞基結(jié)合進(jìn)而激活其靶基因[4]，影響紅細(xì)胞的生成、炎癥及糖代謝，是機(jī)體缺氧反應(yīng)的重要標(biāo)志物，被稱為“缺氧基因表達(dá)的總開關(guān)”。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glucose transporter 1，Glut-1)是最早發(fā)現(xiàn)并且在人體內(nèi)分布最為廣泛的轉(zhuǎn)運(yùn)體，是HIF-1α的下游調(diào)控因子，二者在低氧反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，被視為維持機(jī)體內(nèi)氧平衡的主要調(diào)節(jié)因子[5]。

前期研究表明，機(jī)體缺氧與胰島素敏感性降低有關(guān)，但其具體作用及分子機(jī)制尚未闡明。關(guān)于胰腺β細(xì)胞功能的研究表明，常氧運(yùn)動(dòng)可在一定程度上改善胰腺β細(xì)胞功能，而慢性間歇低氧可能通過氧化應(yīng)激損害胰腺β細(xì)胞的功能，β細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而導(dǎo)致IR[6]。但Kolesnyk等[7]觀察到，在糖尿病動(dòng)物中，間歇性低氧訓(xùn)練干預(yù)可抑制其胰島的破壞，有助于形成新的腺泡，從而保護(hù)β細(xì)胞的功能。低氧暴露能否加劇脂肪組織的缺氧狀況?在低氧和運(yùn)動(dòng)的雙重影響下HIF-1α和Glut1的表達(dá)如何變化?低氧、運(yùn)動(dòng)及低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)均可以改善飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠血脂代謝，低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)能夠更好地改善血脂代謝[8]，可能是低氧與運(yùn)動(dòng)共同改善了IR。因此，本研究以腎周和睪周脂肪組織為切入點(diǎn)，觀察IR大鼠脂肪組織重量、形態(tài)學(xué)及蛋白表達(dá)的變化，探究低氧運(yùn)動(dòng)對脂肪組織缺氧狀況的影響，為運(yùn)動(dòng)治療肥胖和IR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

5周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證編號：SCXK(京)2012-0001，體重140 g～160 g。 大鼠飼養(yǎng)及訓(xùn)練均于北京體育大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，且已通過北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由飲水，室溫(21±2)℃，相對濕度50% ±10%，晝夜照明，室內(nèi)通風(fēng)良好，隔天稱重。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方案

將大鼠隨機(jī)分為對照組(C，n=8)和高脂組(HFD，n=40)，C組每天均給予足夠的普通飼料喂養(yǎng)，建模組大鼠給予高脂膳食，高脂飼料(research diets，D12492)購于北京博奧派克生物科技有限公司，熱量為5.24 kcal/g(脂肪60%，碳水化合物20%，蛋白質(zhì)20%)。高脂膳食8周后，取HFD組和C組各8只，禁食12 h，對其行腹腔注射葡萄糖耐量 試 驗(yàn) (intraperitonealglucose tolerance test，IPGTT)。腹腔注射50%濃度的葡萄糖，注射劑量按照每公斤體重2 g計(jì)算。分別于注射后0、30、60、120 min尾靜脈采血，血糖儀測定血糖濃度，根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]計(jì)算曲線下面積(AUCBG)。具體操作方法和篩選標(biāo)準(zhǔn)成果已發(fā)表[8]。

將建模成功的大鼠(n=24)隨機(jī)分為常氧安靜組(NC，n=6)、常氧運(yùn)動(dòng)組(NE，n=6)、低氧安靜組(HC，n=6)和低氧運(yùn)動(dòng)組(HE，n=6)，普通飼料喂養(yǎng)，正式實(shí)驗(yàn)前稱重，各組大鼠體重?zé)o顯著性差異。HC組和HE組進(jìn)行低氧干預(yù)，NE組和HE組進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。低氧模擬海拔3 500 m高度，氧濃度約為13.7%，適應(yīng)性訓(xùn)練1周后進(jìn)行為期4周的跑臺運(yùn)動(dòng)，大鼠體重及運(yùn)動(dòng)方案見表1。

表1 大鼠低氧訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)安排Table 1 Rats hypoxia training experimental arrangement

1.3 樣本采集

4周干預(yù)結(jié)束后行IPGTT試驗(yàn)，計(jì)算IR指數(shù)(HOMA-IR)及胰島素敏感性指數(shù)(ISI)。腹腔麻醉取材，稱量各組大鼠體重及腎周和睪周脂肪組織重量，稱重后另取睪周脂肪少許，OCT包埋后投入液氮速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后期制作冰凍切片；取腎周脂肪裝入凍存管中，投入液氮速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，待測。

1.4 主要儀器與試劑

電子精密天平(JA1003)，上海天平儀器廠；冰凍切片機(jī)(LEICAUC6i)，德國；奧林巴斯(OlympusⅨ71)倒置顯微鏡圖像采集系統(tǒng)，日本；垂直板蛋白電泳槽、電轉(zhuǎn)槽及電泳儀，Bio-RAD公司，美國；凝膠成像(Chemi Doc TMXRS)，Bio-RAD 公司，美國；酶標(biāo)儀(xMarkTMMicroplate Spectrophotometer)，Bio-RAD公司。

BCA蛋白定量試劑盒，貨號-23225，Pierce公司；發(fā)光液，貨號-34080MN Super Signal West Pico；化學(xué)發(fā)光底物Thermo SCIENTIFIC；PVDF膜，Millipore公司；預(yù)染蛋白 Marker，貨號 -P7708，NEW ENGLANG BioLabs；HIF-1α 抗體，貨號 -ab2185，abcam公司；Glut-1抗體，貨號 -ab652，abcam 公司；小鼠抗GAPDH單抗，貨號-TA-08，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，貨號-ZB-2301，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，貨號-ZB-2305，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.5 測試指標(biāo)與方法

1.5.1 脂肪組織HE染色

冰凍切片機(jī)上調(diào)節(jié)溫度為-30℃，將樣品厚度調(diào)為12 μm，4%多聚甲醛固定后行HE染色，甘油封片。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本連續(xù)切10張切片，處理完畢后于切片的中心視野處采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0軟件處理圖像。

1.5.2 Western Blot方法檢測脂肪組織中HIF-1α和Glut-1蛋白表達(dá)

電子天平稱量脂肪組織的質(zhì)量，按一定比例加入裂解液，勻漿并離心，取上清液于4℃冰箱暫存。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作方法按照試劑盒說明進(jìn)行。加入上樣緩沖液，充分混勻后100℃加熱10 min，備用。按一定比例配制SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，而后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%BSA封閉2 h后進(jìn)行一抗雜交(HIF-1α1：500，Glut-1 1：500，GAPDH 1：2000)，利用Gel-pro軟件進(jìn)行條帶灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性時(shí)用Bonferroni方法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊時(shí)采用Tamhanes'方法；采用多因素單變量方差分析對低氧和運(yùn)動(dòng)進(jìn)行二者交互作用和主體間效應(yīng)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧運(yùn)動(dòng)對IR大鼠體重的影響

如圖1所示，4周低氧運(yùn)動(dòng)后，NE、HC和HE組較NC組體重顯著下降(P＜0.05)，且體重增長率也低于NC組大鼠；與NE組相比，HC和HE組體重顯著增加(P＜0.05)，體重增長率也高于NE組；與HC組相比，HE組體重顯著下降(P＜0.05)。

多因素單變量方差分析結(jié)果顯示，低氧和運(yùn)動(dòng)都對大鼠體重具有顯著影響(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠脂肪細(xì)胞直徑的變化情況

如圖2所示，對各組大鼠睪周脂肪細(xì)胞行HE染色實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下可見脂肪細(xì)胞NC組體積較大且大小不等，細(xì)胞充盈，有較大脂滴，交界處可見融合，有合成大細(xì)胞的趨勢，有較多的炎性細(xì)胞浸潤；其余3組細(xì)胞體積明顯減小，大小均一且細(xì)胞邊界明顯，炎性細(xì)胞浸潤減少。

圖1 低氧運(yùn)動(dòng)4周后,各組大鼠體重變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果Figure 1 The results of weight changes of rats in each group after 4-week hypoxic exercise

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖3a、3b)，經(jīng)過4周的低氧運(yùn)動(dòng)，各組大鼠的內(nèi)臟脂肪含量較NC組顯著減少(P＜0.05)，且脂肪體重比也明顯下降(P＜0.05)；與NE組相比，HC組大鼠內(nèi)臟脂肪含量和脂肪體重比顯著升高(P＜0.05)，HE與NE組無顯著性差異，但HE組較HC組的內(nèi)臟脂肪含量和脂肪體重比顯著降低(P＜0.05)。

圖2 低氧運(yùn)動(dòng)4周后,10×20倍光鏡下各組大鼠脂肪組織HE染色結(jié)果Figure 2 HE staining results of adipose tissue of rats in each group under 10×20 light microscope

對HE染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖3c)，結(jié)果顯示，與NC組相比，NE、HC、HE 3組的細(xì)胞直徑顯著性減小(P＜0.05)且3組間脂肪細(xì)胞直徑無明顯差異。

多因素單變量方差分析結(jié)果顯示，低氧和運(yùn)動(dòng)均對脂肪重量、體脂比及脂肪直徑的變化具有顯著性影響(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)。

圖3 四周低氧運(yùn)動(dòng)后,各組大鼠內(nèi)臟脂肪重量、體脂比及脂肪細(xì)胞直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果Figure 3 The results of VW,VW/BW and Diameter in each group

2.3 低氧運(yùn)動(dòng)對脂肪組織HIF-1α和Glut-1表達(dá)的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖4)，經(jīng)過4周的低氧運(yùn)動(dòng)，其余三組的HIF-1α的蛋白表達(dá)水平較NC組明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05)；與NE組相比，HC組顯著升高(P＜0.05)，HE組也略有升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；HE組較HC組略有降低但無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 四周低氧運(yùn)動(dòng)后,各組大鼠HIF-1α和Glut-1的蛋白表達(dá)的變化Figure 4 Changes of the expression of HIF-1α and Glut-1 protein

與NC組相比，NE、HC、HE組Glut-1的蛋白表達(dá)均無明顯變化，但HE組較HC組Glut-1的蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

多因素單變量方差分析結(jié)果顯示，低氧和運(yùn)動(dòng)都對HIF-1α表達(dá)有顯著性影響(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)；低氧和運(yùn)動(dòng)對Glut-1表達(dá)不具有顯著性影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 低氧運(yùn)動(dòng)對體重及脂肪組織的影響

本研究選用60%來自脂肪的高脂膳食喂養(yǎng)5周齡雄性SD大鼠，利用一系列動(dòng)態(tài)觀察有效地展現(xiàn)了經(jīng)過4周低氧運(yùn)動(dòng)后，IR大鼠的體重、脂肪重量、睪周脂肪細(xì)胞直徑以及蛋白表達(dá)的變化，為排除個(gè)體差異，計(jì)算脂肪重量與體重比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，其余3組的體重都明顯降低且體重增長也低于NC組，4組的體重增長量分別是初始體重的2.7、1.7、2.4和2.1倍。單獨(dú)低氧較對照組體重也明顯下降，可能是低氧提高了機(jī)體安靜狀態(tài)的代謝率，使脂肪細(xì)胞代謝增強(qiáng)從而減少了脂肪重量。低氧、運(yùn)動(dòng)及低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)都能使體重降低，且單純運(yùn)動(dòng)和低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)效果較好。

本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，4周低氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，各組大鼠胰島素敏感性均有所改善，但低氧對胰島素敏感性的改善不如運(yùn)動(dòng)顯著，可能是因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)能更好的促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glucose Transporter)4向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)了攝取葡萄糖的能力[8]。

伴隨著IR的系統(tǒng)性低度慢性炎癥狀態(tài)的發(fā)展，脂肪組織促炎因子分泌增多，而抗炎因子分泌減少，導(dǎo)致炎癥失衡，大量免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等向脂肪組織聚集，炎性平衡遭到破壞，形成惡性循環(huán)[11]。隨著肥胖的進(jìn)一步發(fā)展，脂肪組織以數(shù)量增多和體積增大為明顯變化，其中體積增大為主要特征。增大的脂肪細(xì)胞和氧氣供應(yīng)比例失衡，導(dǎo)致脂肪組織的局部缺氧，HIF-1α和Glut-1蛋白水平增加[12]。研究發(fā)現(xiàn)，特異性敲除小鼠脂肪細(xì)胞HIF-1α?xí)?dǎo)致肥胖相關(guān)炎癥變化和胰島素抵抗[13]。除受低氧刺激外，HIF-1α轉(zhuǎn)錄也受其他因素的影響，而在脂肪組織中，HIF-1α與肥胖誘導(dǎo)的炎癥和胰島素抵抗有關(guān)[13]。

Kitade等[14]對 C57BL/6J以及 Ccr5-/-小鼠進(jìn)行16周的高脂飲食發(fā)現(xiàn)，肥胖能夠通過Ccr5誘導(dǎo)脂肪組織招募巨噬細(xì)胞，使M1/M2分型發(fā)生改變。本研究通過對各組大鼠睪周脂肪細(xì)胞行HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NC組存在明顯的巨噬細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，細(xì)胞比較飽滿，體積較大且有融合成大細(xì)胞的趨勢，而4周的低氧運(yùn)動(dòng)可以減少巨噬細(xì)胞的浸潤，減小細(xì)胞體積，這種變化在HE組更為明顯。提示，低氧運(yùn)動(dòng)主要通過減小脂肪細(xì)胞的體積使內(nèi)臟脂肪重量下降，進(jìn)而降低脂肪體重比從而達(dá)到體重下降的效果。此外，通過HE染色也觀察到低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)方式對巨噬細(xì)胞浸潤的改善優(yōu)于單純運(yùn)動(dòng)或低氧。

3.2 低氧運(yùn)動(dòng)對脂肪組織缺氧的影響

HIF-1包含α和β亞基，常氧條件下二者穩(wěn)定存在于各組織中，而在低氧和熱應(yīng)力環(huán)境下，觀察到鮑魚腮部和血細(xì)胞中的HIF-1α含量明顯升高而HIF-1β表達(dá)相對穩(wěn)定[15]。Glut-1是一種廣泛分布于人體細(xì)胞膜上的一種轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要功能是維持基礎(chǔ)狀態(tài)下組織細(xì)胞葡萄糖的攝取，對糖代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。但目前對Glut-1的研究主要集中在缺血、缺氧條件下的HIF-1α與Glut-1的變化?；罨腍IF-1α使Glut-1表達(dá)過量，使葡萄糖攝取增加，有助于增加機(jī)體組織對缺血、缺氧等特殊環(huán)境的耐受性[16]。最近研究表明，低氧環(huán)境能夠顯著增加HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞對葡萄糖的攝取，提高Glut-1和Glut-3的表達(dá)[17]，表明HIF-1α和Glut-1在能量代謝中起著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，不管是常氧還是低氧，運(yùn)動(dòng)后脂肪組織HIF-1α蛋白表達(dá)明顯降低，這表明運(yùn)動(dòng)使IR的大鼠脂肪組織缺氧情況得到了顯著改善。并且，進(jìn)行單純低氧干預(yù)也能明顯降低HIF-1α的蛋白表達(dá)，說明機(jī)體雖然處于低氧環(huán)境，但在此低氧條件下卻能夠顯著緩解因IR造成的缺氧狀態(tài)，可能是因?yàn)榈脱跆岣吡藱C(jī)體安靜狀態(tài)的代謝率，使脂肪細(xì)胞直徑減小，緩解了缺氧狀態(tài)，這也與黃徐根等[18]研究的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4周低氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后Glut-1的蛋白表達(dá)有下降的趨勢，且在低氧復(fù)合運(yùn)動(dòng)后表達(dá)顯著降低，表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，低氧運(yùn)動(dòng)對IR大鼠脂肪組織的葡萄糖代謝影響不明顯?？紤]到Glut-1是HIF-1α的下游調(diào)控因子，這也與HIF-1α的表達(dá)一致，即低氧環(huán)境能刺激Glut-1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖的攝取。之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4周的低氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)能明顯改善IR大鼠對胰島素的敏感性從而促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，但本實(shí)驗(yàn)中Glut-1的表達(dá)并無顯著變化，這可能是由于低氧運(yùn)動(dòng)提高了Glut-1攝取葡萄糖的效率，使Glut-1表達(dá)量并無顯著增加因而導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，由于Glut-1廣泛分布于機(jī)體各組織器官，通常與其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型共同承擔(dān)細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[19]，另外一種可能是在本實(shí)驗(yàn)中，Glut-1并不是主要改善IR大鼠對葡萄糖攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。楊貴明等[20]對高脂飲食誘導(dǎo)IR大鼠進(jìn)行4周的間歇性低氧暴露，發(fā)現(xiàn)間歇低氧結(jié)合運(yùn)動(dòng)能夠顯著改善IR大鼠的抗氧化能力，而運(yùn)動(dòng)可通過激活線粒體自噬進(jìn)而改善機(jī)體能量代謝，緩解IR[21]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，間歇低氧暴露改善大鼠的IR程度可能是由于改善了機(jī)體的抗氧化能力，增強(qiáng)了線粒體功能，清除了受損的線粒體，激活自噬，進(jìn)而改善了IR程度。

間歇低氧運(yùn)動(dòng)可以通過刺激機(jī)體其他部位對糖的攝取、增強(qiáng)線粒體的功能進(jìn)而提高了機(jī)體的有氧代謝，使IR大鼠體重下降，增強(qiáng)了胰島素敏感性，改善了IR程度。因此，為進(jìn)一步闡明低氧與運(yùn)動(dòng)干預(yù)對IR的作用機(jī)制，一方面可從骨骼肌線粒體著手，觀察線粒體的生物合成和功能變化；另一方面可從脂肪組織的巨噬細(xì)胞入手，觀察兩種因素的干預(yù)對脂肪組織巨噬細(xì)胞分型和炎癥的影響，從而為運(yùn)動(dòng)改善IR提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)能夠有效降低IR大鼠的體重增長幅度，尤其是低氧運(yùn)動(dòng)能使大鼠體脂成分顯著下降。

低氧暴露并未加劇IR大鼠脂肪組織的缺氧狀況，反而能使體重降低，對脂肪組織的缺氧有改善作用。

常氧和低氧運(yùn)動(dòng)都能夠通過減小脂肪細(xì)胞直徑改善其缺氧狀況，但并未對脂肪組織Glut-1的表達(dá)產(chǎn)生影響。