王浩毓，趙惠玲，李宏全*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.太原師范學(xué)院 生物系，山西 太原 030012)

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，在全世界惡性腫瘤的發(fā)病率中占第5位，在腫瘤引起死亡的排名中居于第3位[1]，具有高發(fā)病率、高侵襲性、高轉(zhuǎn)移率、預(yù)后差等臨床特點(diǎn)。因其發(fā)病的分子機(jī)制至今沒有明確而成為較為難治療的疾病之一[2]。隨著早期診斷技術(shù)的提高，患者的存活率也開始有一定提高，但仍有一部分晚期肝癌難以切除，且易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3]。肝癌的治療方法主要是綜合治療，包括化療、放療、手術(shù)切除、免疫治療以及介入治療等[4]。單孔腹腔鏡的普及為肝癌的手術(shù)治療做出了一定的貢獻(xiàn)，為減輕患者疼痛，減少術(shù)后感染提供了保障，但對于晚期肝癌來說，并未做到根本性改善[5]。除此之外，臨床上還有射頻消融 (RFA)、高頻熱療 (HFH) 以及樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 (DC/CIK)等較為新型的治療方式，但因投入應(yīng)用的案例還較少，而無法詳細(xì)了解其療效[6]。到目前為止，依然沒有出現(xiàn)能徹底消滅癌細(xì)胞，并且副作用較小的治療方案。因此，開發(fā)高效、低毒的新型抗肝癌藥物仍是當(dāng)務(wù)之急。

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)是我國一種傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒、涼血止血的功效，主治熱痢膿血、熱淋、帶下、痛腫惡毒、丹毒[7]，其提取物已被證實具有抗氧化、抗腫瘤[8]、增強(qiáng)免疫、抗衰老[9]、抗炎、抑菌[10]、保護(hù)神經(jīng)元[11]、降血糖[12]等作用。馬齒莧中含有槲皮素、山柰酚、木犀草素[13]以及3,4-二羥基苯乙醇等[14]多種多酚。

多酚是廣泛存在于植物性食物中一種化合物，具有很好的抗氧化作用，且經(jīng)流行病學(xué)數(shù)據(jù)證明是安全無毒的，并對人類健康有持久有利的影響[15]。近年來，人們對多酚進(jìn)行了更加深入的研究，并發(fā)現(xiàn)該化合物具有除抗氧化外還具有更廣泛的作用。于萍[16]曾發(fā)現(xiàn)葡多酚可促進(jìn)正常乳腺細(xì)胞的增殖活性并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，但對乳腺癌細(xì)胞增殖活性有抑制作用且呈一定的濃度依賴關(guān)系。Shan等[17]從棗中提取結(jié)合態(tài)多酚，并發(fā)現(xiàn)其在裸鼠腫瘤模型中表現(xiàn)出了抗腫瘤活性，且對正常器官不造成損傷。史江穎等[18]發(fā)現(xiàn)谷糠結(jié)合態(tài)多酚對人肝癌細(xì)胞(HepG-2)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-7)具有顯著的增殖抑制作用。

多酚根據(jù)其存在的形態(tài)可分為自由態(tài)(或游離態(tài))多酚和結(jié)合態(tài)多酚。自由態(tài)多酚一般為單體形式，并以物理方式吸附于植物性食物基質(zhì)中。因此，自由態(tài)多酚易溶于有機(jī)溶劑或水。結(jié)合態(tài)多酚則是由共價鍵與植物細(xì)胞壁等基質(zhì)結(jié)合，因此較難提取，一般采取酸或堿水解提取。本文以馬齒莧自由態(tài)多酚(free polyphenol inPortulacaoleraceaL, FPPO)和結(jié)合態(tài)多酚(bound polyphenol inPortulacaoleraceaL., BPPO)為干預(yù)材料，以肝癌細(xì)胞HepG-2為模型，對馬齒莧多酚抑制HepG-2肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)HepG-2凋亡作用進(jìn)行了初步研究，旨在尋找低毒有效的抗肝癌藥物。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細(xì)胞株

肝癌細(xì)胞株 HepG-2，由山西省腫瘤醫(yī)院中心實驗室郭素堂教授惠贈。

1.1.2 藥物與試劑

馬齒莧 (PortulacaoleraceaL.) 采集于山西省壽陽縣朝陽鎮(zhèn)中曲村的田間，并由北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉全儒教授鑒定，確認(rèn)為野生馬齒莧；Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性檢測試劑盒、Bradford法蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)；RPMI Medium1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜、胰蛋白酶、沒食子酸、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、鹽酸、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、氫氧化鈉等均購于北京索萊寶；四季青無支原體胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；離心機(jī)購自德國Hettich科學(xué)儀器公司；超純水儀購自英國ELGA公司；分光光度計購自中國濟(jì)南博華儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱購自英國RS Biotech公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS株式會社；酶標(biāo)購自瑞士TECAN公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬齒莧結(jié)合態(tài)與自由態(tài)多酚的提取與含量測定

自由態(tài)多酚的提?。簩⒉杉降鸟R齒莧室溫下干燥，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過80目篩，分析天平稱取20 g粉末，加入-20 ℃預(yù)冷的75%丙酮500 mL 攪拌20 min，4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，沉淀按上述步驟再處理一遍并收集上清。將2次收集到的上清液 45 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200 mL，并依次分裝在10 cm 培養(yǎng)皿中，經(jīng)冷凍干燥機(jī)持續(xù)處理24 h，即得到FPPO[17]。

結(jié)合態(tài)多酚的提?。簩⑻崛∽杂蓱B(tài)多酚后的殘留物中加入200 mL 2 mol·L-1的NaOH 進(jìn)行消化反應(yīng)，室溫下攪拌1 h，加HCl 使 pH=7以終止反應(yīng)，再加入200 mL己烷，反應(yīng)20 min除去脂質(zhì)，4 000 r·min-1離心10 min, 收集上清，重復(fù)上述步驟一次。將收集到除脂后的液體中加入200 mL 乙酸乙酯提取20 min, 4 000 r·min-1離心10 min, 收集除脂的液體，重復(fù)上述步驟3次。將提取液45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200 mL，真空冷凍干燥，最終得到BPPO[17]。

馬齒莧多酚的含量測定：以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，福林酚法檢測多酚的濃度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1932x-0.0207(R2=0.994)計算自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚的含量。

1.2.2 HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)

冷凍的HepG-2細(xì)胞復(fù)蘇后，在無菌操作狀態(tài)下接入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%的胎牛血清1640培養(yǎng)基，放到37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間觀察更換培養(yǎng)基。待HepG-2細(xì)胞對數(shù)生長至培養(yǎng)瓶底95%時，傳代培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測FPPO和BPPO對HepG-2細(xì)胞的抑制率

當(dāng)HepG-2細(xì)胞對數(shù)生長至培養(yǎng)瓶底的95%時，0.2%胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min，1640培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104個·mL-1，每孔100 μL接入96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，更換新的加入多酚的培養(yǎng)基，多酚濃度梯度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g·L-1，每個濃度平行5個孔，培養(yǎng)12 h、24 h和36 h后，加入20 μL MTT, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去液體，加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀搖動10 min，570 nm波長測定吸光度值。根據(jù)抑制率/%=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%計算不同濃度和不同時間多酚作用下的抑制率。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將傳代培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞調(diào)整濃度至5×104個·mL-1，接入12孔板中，每孔1 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h且完全貼壁后，更換新的加入多酚的培養(yǎng)基，多酚濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3 g·L-1，培養(yǎng)24 h，OLYMPUS倒置顯微鏡拍照(20X)觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)實驗

1.2.5.1 BPPO對HepG-2細(xì)胞周期影響實驗

傳代懸浮的HepG-2細(xì)胞，調(diào)整濃度至5×104個·mL-1，接入直徑6 cm的皿中，每皿3 mL，搖勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，更換含有BPPO的培養(yǎng)基，BPPO濃度分別為0、0.1、0.2、0.3 g·L-1，每個濃度重復(fù)3次。培養(yǎng)24 h后，0.2%胰酶消化，PBS洗滌2次，70%酒精固定24 h，PBS洗滌固定液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個·mL-1，加入100 μL RNaseA，再加入400 μL PI，避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5.2 BPPO誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡實驗

HepG-2細(xì)胞傳代、鋪皿、BPPO干擾、胰酶消化PBS洗滌離心后，加入195 μL AnnexinV-FITC結(jié)合液，5 μL AnnexinV-FITC，10 μL碘化丙啶，搖勻，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5.3 BPPO對HepG-2細(xì)胞線粒體膜電位影響實驗

HepG-2細(xì)胞BPPO干擾、胰酶消化、PBS洗滌與1.2.5.1相同，PBS洗滌離心后，加入1640培養(yǎng)基和JC-1染色工作液各500 μL，37 ℃恒溫箱中溫浴20 min，JC-1染色緩沖液洗滌離心后懸浮HepG-2細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 BPPO對HepG-2細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9酶活性影響實驗

HepG-2細(xì)胞經(jīng)BPPO干擾、胰酶消化、PBS洗滌離心后，加入100 μL裂解液，冰浴裂解15 min，根據(jù)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9檢測試劑盒說明書加樣，搖勻后37 ℃反應(yīng)90 min，酶標(biāo)儀檢測A405吸光度值，計算Caspase酶活力單位。

1.3 統(tǒng)計分析

每個樣品至少3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表P<0.05示。方差分析及相關(guān)性分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，多重比較采用S-N-K法。柱形圖、線型圖采用SPSS 22.0軟件繪制。細(xì)胞周期圖、細(xì)胞凋亡圖、線粒體膜電位圖由FACSCalibur流式細(xì)胞儀生成。顯著性水平為P<0.05 或P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧結(jié)合態(tài)多酚和自由態(tài)多酚的含量

丙酮作為常用的有機(jī)溶劑可以將FPPO溶出，并去除大部分雜質(zhì)。用NaOH處理殘留物，可以使BPPO與植物基質(zhì)間的化學(xué)鍵高效水解，游離到溶劑當(dāng)中。利用福林酚法檢測多酚含量，代入用沒食子酸建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，測得BPPO濃度約為5.912 g·L-1，F(xiàn)PPO為8.267 g·L-1。20 g馬齒莧干粉末最終提取出約71 mg BPPO，264.5 mg FPPO。FPPO的提取率顯著高于BPPO(見表1)。

表1 BPPO和FPPO含量/mgTable 1 The contents of bound and free polyphenols in Portulaca oleracea L.

注：A、B、C...等大寫字母表示檢測指標(biāo)達(dá)到0.01顯著性水平差異，a、b、c...等小寫字母表示檢測指標(biāo)達(dá)到0.05顯著性水平差異。

Note：the capital letters (A, B, C etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.01 (P<0.01), the lower case letters (a, b, c etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.05 (P<0.01).

2.2 馬齒莧兩種形態(tài)多酚對HepG-2肝癌細(xì)胞的抑制作用

BPPO對HepG-2細(xì)胞的抑制率呈劑量依賴性增長，0.4 g·L-1時抑制率最高(圖1，圖2)。隨著處理時間的增加(12、24、36 h)，其抑制率也逐步變強(qiáng)，36 h、0.4 g·L-1下的作用效果最強(qiáng)，抑制率達(dá)到了73%(見圖1右)。FPPO由于作用效果太弱，在12、24 h抑制率幾乎為0(圖1B)。在相同時間內(nèi)，BPPO對HepG-2的抑制作用在各濃度梯度上(0.0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g·L-1)均明顯強(qiáng)于FPPO(圖2)。

圖2 相同處理時間、不同處理濃度下FPPO與BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞的抑制率比較Fig.2 Inhibition analysis of FPPO and BPPO on HepG-2 hepatoma cells at same treatment time

為了更明了地探究BPPO對HepG-2抑制效果與處理時間的關(guān)系，我們計算了結(jié)合態(tài)多酚不同處理時間下的IC50值。隨著作用時間延長，IC50值極顯著地減小。12 h、24 h、36 h的IC50值依次為0.325、0.273、0.216 g·L-1，三者之間均達(dá)到極顯著性差異(P<0.01)。這說明BPPO對HepG-2細(xì)胞的抑制作用隨著時間的延長而顯著增強(qiáng)(圖3)。

2.3 BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可見，在倒置顯微鏡下觀察HepG-2肝癌細(xì)胞經(jīng)BPPO處理24 h后的細(xì)胞形態(tài)，對照組細(xì)胞形態(tài)呈梭形，細(xì)胞之間緊密連接，貼壁牢固；HepG-2肝癌細(xì)胞經(jīng)BPPO處理5 h開始回縮，逐漸變圓，細(xì)胞形態(tài)變化與BPPO的作用時間和濃度呈正相關(guān)，隨著BPPO濃度增加，細(xì)胞變圓的數(shù)量增加，隨著作用時間不斷延長，圓形細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部，漂浮到細(xì)胞培養(yǎng)液中。

圖3 BPPO不同時間作用于HepG-2肝癌細(xì)胞的半抑制濃度Fig.3 The half maximal inhibitory concentration of BPPO on HepG-2 cells at different time

圖4 不同濃度BPPO作用下的HepG-2肝癌細(xì)胞形態(tài)圖Fig.4 The HepG-2 cells’ morphology after treated by different concentration of BPPO

2.4 BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞周期的影響

本試驗利用流式細(xì)胞儀檢測了BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞周期分布的影響，由圖5可見，與對照組相比，隨著處理濃度的增加G1期細(xì)胞比例呈劑量依賴性顯著下降(P<0.01)；隨著處理濃度的增加S期細(xì)胞的比例呈劑量依賴性增加(P<0.05)，且除低劑量組之外，均極顯著地高于對照組(P<0.01)；G2期細(xì)胞比例隨著處理濃度的增加呈劑量依賴性下降(P<0.05)。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明BPPO將HepG-2細(xì)胞阻滯在了S期。

2.5 BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞凋亡的影響

圖6結(jié)果顯示，在BPPO作用下，隨著處理濃度增加，正常細(xì)胞的比率極顯著地降低，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比率極顯著地增加。且在早期凋亡中，相比于對照組的1.72%，高劑量組的凋亡比例增加到了 54.62%，達(dá)到極顯著性差異(P<0.01)。

2.6 BPPO對 HepG-2肝癌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性的影響

圖7結(jié)果表明，隨著馬齒莧結(jié)合態(tài)多酚處理濃度的增加，HepG-2肝癌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8 酶活性隨著處理濃度的增加，酶活性極顯著地提高，在0.0、0.1、0.2、0.3 g·L-1濃度相互之間均達(dá)到極顯著性差異(P<0.01)。Caspase-9酶活性也是隨著BPPO處理濃度的增加而增加，0.1 g·L-1濃度處理與對照之間差異極顯著(P<0.01)，0.2、0.3 g·L-1處理與對照和 0.1 g·L-1濃度處理之間存在極顯著差異(P<0.01)。

2.7 BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖8為JC-1法檢測的HepG-2肝癌細(xì)胞線粒體膜電位，結(jié)果顯示，隨著BPPO處理濃度的增加，線粒體膜電位下降程度極顯著地提高，由對照組的 11.41%增加到了高濃度組的54.52%，達(dá)到極顯著性差異(P<0.01)。

圖5 不同濃度BPPO作用下的HepG-2肝癌細(xì)胞周期圖Fig.5 The cell cycle diagrams of HepG-2 hepatoma cells after treated by different concentration of BPPOA、B、C...等大寫字母表示檢測指標(biāo)達(dá)到0.01顯著性水平差異，a、b、c...等小寫字母表示檢測指標(biāo)達(dá)到0.05顯著性水平差異，下圖同。The capital letters (A, B, C etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.01 (P<0.01), the lower case letters (a, b, c etc) indicate that the significant differences between each of detection indexes have reached a level of 0.05 (P<0.01), the same as the figures below.

圖6 AnnexinV-FITC染色檢測到的HepG-2肝癌細(xì)胞凋亡圖Fig.6 Apoptosis diagram of HepG-2 hepatoma cellsdetected by Annexin V-FITC staining after BPPO treatmentLL象限代表活細(xì)胞；LR象限代表早期凋亡；UR象限代表晚期凋亡；UL象限代表壞死。The LL quadrant represents living cells; the LR quadrant represents early apoptosis; the UR quadrant represents late apoptosis; the UL quadrant represents necrosis.

圖7 BPPO對HepG-2 細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性影響Fig.7 Effects of BPPO on Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9 enzymes activity in HepG-2 cells

圖8 JC-1法檢測HepG-2肝癌細(xì)胞線粒體膜電位圖Fig.8 Mitochondrial membrane potential detected by JC-1on HepG-2 hepatoma cells after treatment of different BPPO concentration

3 討論

3.1 關(guān)于馬齒莧多酚

馬齒莧是一種常見的一年生草本植物，具有抗氧化、抗衰老和改善認(rèn)知的功能。馬齒莧抗腫瘤的作用在近年來也得到了驗證。 Zhao等[19]研究表明，馬齒莧中的水溶性多糖POL-P3b可以顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞；Shen[20]發(fā)現(xiàn)馬齒莧中的多種糖類都可以抑制sacroma 180在小鼠體內(nèi)的增長。

多酚是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于蔬菜和水果以及種子的麩皮中[21]。多酚的主要功能為抗氧化和抗微生物[22]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)多酚具有一定的抗癌作用。董麗華[23]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚能顯著抑制人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，并誘導(dǎo)其凋亡；高曉天[24]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡；章迅[25]研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚能夠抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的增殖。多種多酚都對HepG-2肝癌細(xì)胞具有抑制作用，史江穎[18]研究表明，谷糠結(jié)合態(tài)多酚對HepG-2肝癌細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用；Shan[17]研究表明，棗結(jié)合態(tài)多酚對HepG-2肝癌細(xì)胞也有明顯的增殖抑制作用。

馬齒莧富含山柰酚、芹黃素、木犀草素、楊梅素和槲皮素等多酚類化合物。因此，研究馬齒莧中多酚的抗癌作用具有很大的臨床意義，為天然藥物治療和緩解癌癥提供了一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。本實驗從馬齒莧中提取了BPPO和FPPO2種類型的多酚，并詳細(xì)研究了該多酚對HepG-2肝癌細(xì)胞的抑制作用。

3.2 BPPO抑制HepG-2肝癌細(xì)胞增殖

本研究利用MTT法檢測BPPO和FPPO對HepG-2細(xì)胞抑制率，結(jié)果表明(圖1)，BPPO能夠抑制HepG-2肝癌細(xì)胞增殖，并具有時間和濃度依賴性，36 h BPPO的IC50值達(dá)到最低，為0.216 g·L-1(圖3)。BPPO在24 h對HepG-2的IC50值為0.273，相同時間下谷糠結(jié)合態(tài)多酚對HepG-2的IC50值為0.84 g·L-1[18]，棗結(jié)合態(tài)多酚對HepG-2的IC50值為0.3 g·L-1[17]，均高于本實驗的測定值，表明不同來源的結(jié)合態(tài)多酚對HepG-2肝癌細(xì)胞的敏感性是不同，BPPO的抑制作用優(yōu)于棗結(jié)合態(tài)多酚和谷糠結(jié)合態(tài)多酚。

FPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞作用相對較弱，其作用濃度0.4 g·L-1、作用時間36 h時抑制率僅為15.7%，抑制率達(dá)到30%以上時，才能確定細(xì)胞會發(fā)生凋亡，故本文著重對BPPO做了研究。

3.3 BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞周期的影響

S期是細(xì)胞DNA合成期。組蛋白也是在這一時期合成，染色體的構(gòu)成離不開組蛋白。本研究結(jié)果表明，BPPO將HepG-2細(xì)胞阻滯在S期，而對該細(xì)胞的G1期和G2期沒有顯著影響，而G2期的細(xì)胞含量少于G1期和S期。說明BPPO可能破壞了HepG-2細(xì)胞內(nèi)的堿基，損傷的堿基不能進(jìn)行DNA合成，使G1期細(xì)胞減少,使G2期細(xì)胞無法大量合成有絲分裂所需蛋白，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HepG-2肝癌細(xì)胞凋亡。BPPO還可能通過影響組蛋白的乙酰化修飾，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的DNA的合成，這一推測還有待進(jìn)一步探究[26]。Shan等[17]發(fā)現(xiàn)棗結(jié)合態(tài)多酚可將HepG-2肝癌細(xì)胞周期阻滯在S期，與本研究中的 BPPO作用結(jié)果一致。

3.4 BPPO誘導(dǎo)HepG-2肝癌細(xì)胞凋亡

本研究通過利用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)(圖5)證明了BPPO可誘導(dǎo)HepG-2肝癌細(xì)胞的凋亡。在此基礎(chǔ)上，本研究通過探究BPPO對HepG-2肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響以及其對膜受體通路的影響來進(jìn)一步說明BPPO對 HepG-2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

在膜受體凋亡通路中，Caspase 8是關(guān)鍵，它在被誘導(dǎo)活化后可激活其效應(yīng)物Caspase 3。Caspase 3 經(jīng)激活后可水解成活性酶的形式，形成級聯(lián)反應(yīng)，催化DNA修復(fù)酶(polyADP-ribosepolymerase，PARP)的裂解，并在其他酶的協(xié)同作用下裂解整個細(xì)胞[27]。

經(jīng)證明，多酚具有誘導(dǎo)Caspase 8激活的功能。李萍等[28]發(fā)現(xiàn)茶多酚能夠激活A(yù)CC-M細(xì)胞中Caspase8， Gupta等[29]發(fā)現(xiàn)茶多酚可誘導(dǎo)人類前列腺癌細(xì)胞Caspase8活性增加。本研究利用Caspase檢測試劑盒對BPPO作用下的HepG-2細(xì)胞中的Capase 8、Capase 3和Capase 9進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示Caspase 3和Caspase 8均有所升高，從而證明了BPPO通過膜受體通路誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡。此外，由于Caspase 9也升高，因此可推測HepG-2的凋亡和線粒體膜電位降低有關(guān)。

線粒體的變化同樣可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡前期，細(xì)胞膜電位的降低，可使具有調(diào)控能量代謝和細(xì)胞凋亡雙重功能的 CytC等釋放于胞漿內(nèi)，并與細(xì)胞凋亡酶活化因子1結(jié)合，在dATP的幫助下激活Caspase 9,進(jìn)而激活Caspase 3,從而形成級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡[30]。同時，線粒體膜的損傷，也會使線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，導(dǎo)致生成細(xì)胞三磷酸腺苷減少，加速了細(xì)胞凋亡進(jìn)程[31]。

本研究在BPPO作用于HepG-2使其Caspase 9升高的基礎(chǔ)上，對其線粒體膜電位進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示在BPPO處理后的HepG-2細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降，從而證明BPPO可通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究表明，對HepG-2細(xì)胞而言，BPPO對其有較強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量依賴型。FPPO對HepG-2細(xì)胞的影響則不明顯。此外，BPPO很可能是通過通過激活膜受體通路和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡，從而對肝癌細(xì)胞起到抑制作用。

肝癌由于其易復(fù)發(fā)易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，而成為一種很難治愈的疾病。近年來，人們不斷嘗試新的治療方法，旨在擺脫毒副作用大的傳統(tǒng)療法。一些生物類藥物在這方面取得一定進(jìn)展，但仍不能成為符合預(yù)期的高效藥物。馬齒莧多酚作為一種純天然提取物，在減少身體損傷，提高治愈率方面，具有很好的前景。

馬齒莧的自由態(tài)多酚與結(jié)合態(tài)多酚對肝癌細(xì)胞的抑制功效的差異很可能是因為兩者所含的酚類化合物有所不同。因此，我們下一步將基于此推測，對馬齒莧多酚的種類進(jìn)行更深入的研究，以期找到對肝癌細(xì)胞作用最大的酚類化合物，并利用小鼠模型探究其體內(nèi)功能。

4 結(jié)論

綜上所述，BPPO可以顯著抑制HepG-2肝癌細(xì)胞的增殖，且具有時間和濃度依賴性，同時對細(xì)胞的形態(tài)也有明顯的影響。BPPO可以阻滯HepG-2肝癌細(xì)胞周期至S期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活性的升高和細(xì)胞線粒體膜電位的下降表明，BPPO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過是激活膜受體通路和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路來完成的。