劉皎皎 戴 玲 董 璐 何瑾瑜 李瀚旻

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 710003)

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明確因素對肝造成損傷，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積為主的一類綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化[1]。其相關(guān)發(fā)病機制尚未完全闡明。有研究報道，胰島素抵抗、氧化反應(yīng)、脂質(zhì)在肝臟蓄積以及炎癥反應(yīng)這幾個方面與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)[2,3]。目前缺乏針對NAFLD有效的治療手段，臨床上主要使用胰島素增敏劑、抗氧化劑、調(diào)脂藥以及護肝藥物治療NAFLD，但治療效果不盡人意，并且臨床及實驗發(fā)現(xiàn)部分藥物會產(chǎn)生明顯的毒副作用，對患者自身傷害較大。而中醫(yī)藥治療NAFLD具有多角度、多層次、多途徑、多靶點，且療效穩(wěn)定持久，毒副作用較小等優(yōu)勢，已成為目前研究的熱點[4]。

虎杖苷是一種多酚、非黃酮類植物抗毒素，在虎杖、葡萄和花生中的含量較高。研究報道，虎杖苷具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抗心血管疾病等作用[5]。虎杖具有清熱、破瘀及利濕等功效，自古以來常用來治療肥胖、黃疸、脅痛等疾病[6]，虎杖苷作為中藥虎杖的主要活性成分之一，在降脂、保護肝細(xì)胞等方面具有重要的效果。目前，研究表明虎杖苷能夠降低大鼠體重、血脂，且能改善肝功能異常，在治療非酒精性脂肪肝治療中顯現(xiàn)初步的療效[7，8]，而本實驗旨在進一步闡明其相關(guān)機制，為臨床使用虎杖苷治療NAFLD奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 健康的雄性SD大鼠42只，體重180～200 g，SPF級，由陜西省中醫(yī)醫(yī)院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(陜)2013-003?；⒄溶?>98%，HPLC，購自南京廣潤生物制品有限公司，批號：GR-133-131018)；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒、血糖測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；大鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海江林生物科技有限公司。PPAR-α一抗(Abcam,ab8934)、LXR-α一抗(Abcam,ab176323)、SREBP-1c一抗(Abcam,ab28481)，羊抗兔二抗(cell signaling technology,#5151)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與分組 大鼠稱重后分籠喂養(yǎng)，正常喂養(yǎng)1周后隨機分為5組：正常組(A組，9只)、模型組(B組，9只)、虎杖苷劑量組1[C1組，8只，50 mg/(kg·d)]、虎杖苷劑量組2[C2組，8只，100 mg/(kg·d)]以及虎杖苷劑量組3[C3組，8只，200 mg/(kg·d)]。5組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。A組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其他4組大鼠給予高脂飼料，造模期間實驗動物自由進食和飲水，動物房保持安靜，自然采光，溫度保持25℃左右。喂養(yǎng)持續(xù)8周后，從A組和B組中隨機挑選1只大鼠，取肝臟做病理切片，驗證模型組大鼠非酒精性脂肪肝的形成。依據(jù)《NASH 臨床研究網(wǎng)病理工作組指南》內(nèi)容對肝組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)進行評價[9]，并對NAS積分進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.2給藥 A組和B組給予生理鹽水灌胃，5 ml/次。C1、C2、C3組分別以50、100、200 mg/(kg·d)的虎杖苷混懸液灌胃，持續(xù)4周。

1.2.3檢測指標(biāo) ①造模后第12周當(dāng)晚大鼠禁食不禁水，次日腹腔注射麻醉，腹動脈取血10 ml，離心分離血清，-20℃保存。迅速提取肝臟稱重，生理鹽水沖洗后在肝右葉邊緣1 cm處橫切2塊肝組織，一塊用中性福爾馬林固定，進行HE染色后觀察病理學(xué)改變，另一塊用來制備組織勻漿。②按照試劑盒說明書測定GST、SOD及MDA含量。③提取組織勻漿中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行實時定量PCR檢測炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)水平。PCR擴增引物序列為TNF-α上游引物：5′-ATGAGCACAGAAAGCATGATG-3′，下游引物：5′-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3′；IL-6上游引物：5′-TTGCCGAGTAGACCTCATAGTGACC-3′，下游引物：5′-CAAGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3′。④按照試劑盒說明書，采用酶法測定血清血糖(FBG)，采用放射免疫方法測定空腹胰島素水平(FNS)。并計算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)=FBF×FNS/22.5；胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/(FBG×FNS)。⑤提取肝組織蛋白，采用Western blot方法檢測PPAR-α、LXR-α、SREBP-1c蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1肝臟大體性狀和病理觀察 A組大鼠肝臟包膜光滑完整，表面顏色呈暗紅色，光潤，邊緣銳利，切面細(xì)顆粒感，無油膩感。B組大鼠肝臟呈棕黃色，無光澤，表面細(xì)小顆粒感，邊緣鈍?；⒄溶战M大部分顏色暗紅，潤澤，切面無油膩感。C1及C2組大鼠肝臟呈淡黃色，切面油膩感。

A組肝細(xì)胞小葉結(jié)構(gòu)清晰，胞漿均質(zhì)紅染，小靜脈、膽管和匯管區(qū)小動脈結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝竇清晰可見，肝細(xì)胞胞漿粉染，顆粒大小均勻。模型組肝細(xì)胞腫脹，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂滴空泡，部分肝細(xì)胞呈氣球樣變，肝索排列紊亂。C3組有明顯改善，其脂肪滴與模型組相比明顯減少，如圖1。同時， 對肝組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)進行評價后，各組NAS 積分情況如表1所示，虎杖苷能降低NAFLD大鼠模型的NAS積分，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明虎杖苷對NAFLD具有一定的治療作用。

2.2虎杖苷對各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激的影響 結(jié)果如表2所示，與A組比較，B組SOD和GST含量均顯著性降低，而MDA顯著性升高。與B組比較，虎杖苷各劑量組中SOD和GST含量顯著性升高，而MDA顯著性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3虎杖苷對各組大鼠TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的影響 與A組比較，B組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)均顯著性增加，給予虎杖苷后，大鼠肝臟中TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)明顯降低。與B組比較，C2及C3組TNF-α表達(dá)顯著性降低，C1、C2及C3組IL-6表達(dá)顯著性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖2。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色(×400)Fig.1 HE staining of liver tissue of each group of rats(×400)

2.4虎杖苷對各組大鼠體內(nèi)IR的影響 如表3所示，與A組比較，B組FBG、FNS及IR顯著性升高，而ISI顯著性降低。與B組比較，C2及C3組FBG、FNS及IR顯著性降低，而ISI顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5虎杖苷對各組大鼠PPAR-α、LXR-α、SREBP-1c蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖3所示，與A組比較，B組PPAR-α蛋白表達(dá)顯著性降低，LXR-α、SREBP-1c蛋白表達(dá)顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與B組比較，C2和C3組LXR-α、SREBP-1c表達(dá)顯著性下調(diào)，而PPAR-α蛋白無明顯變化。

表1 NAS積分在各組間的比較情況Tab.1 Comparison of NAS scores between

Note：Compared with group A,1)P<0.05;compared with group B，2)P<0.05.

表2 虎杖苷對各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激的影響Tab.2 Effect of polydatin on oxidative stress in liver tissue of rats in each group

Note：Compared with group A,1)P<0.05;compared with group B，2)P<0.05.

圖2 虎杖苷對各組大鼠TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of polydatin on expression of TNF-α and IL-6 mRNA in each groupNote: Compared with group A,*.P<0.05;compared with group B，#.P<0.05.

表3 虎杖苷對各組大鼠體內(nèi)IR的影響Tab.3 Effect of polydatin on IR in rats

Note：Compared with group A,1)P<0.05;compared with group B,2)P<0.05.

圖3 虎杖苷對各組大鼠PPAP-α、LXR-α、SREBP-1c蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of polydatin on expression of PPAP-α,LXR-α and SREBP-1c in ratsNote: Compared with group A,*.P<0.05;compared with group B，#.P<0.05.

3 討論

NAFLD是一類與遺傳、環(huán)境和代謝相關(guān)的疾病，目前尚缺乏有效的治療藥物。NAFLD多系過食肥甘厚味，臨床多以肥胖、乏力，脅肋部隱痛或脹痛，口苦，舌苔黃、厚等為主要表現(xiàn)，屬中醫(yī)“肥胖”、“黃疸”、“肝脹”、“脅痛”等范疇[10]。而虎杖苷作為虎杖中重要的活性成分，藥理學(xué)研究表明其具有降血脂，保肝作用，但相關(guān)機制尚未闡明，因此，本研究旨在探究虎杖苷對NAFLD的影響的相關(guān)分子機制。

肝細(xì)胞內(nèi)含有大量的線粒體可以產(chǎn)生ATP，為肝細(xì)胞提供能量，并在此過程中產(chǎn)生大量的活性氧[11]。如果沒有相應(yīng)的抗氧化機制，很容易引起肝細(xì)胞損傷[12]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠脂質(zhì)大量沉積，肝組織SOD、GST顯著性降低，MDA顯著性升高，因此，氧化應(yīng)激在脂肪肝的形成和進展中可能發(fā)揮了重要的作用。而給予大鼠虎杖苷后，其SOD和GST的含量明顯升高，且MDA明顯降低，起到了明顯的抗氧化作用。同時劑量越大，效果越明顯。因此，虎杖苷可能是通過抗氧化作用，抑制脂質(zhì)過氧化，減輕肝臟沉積來治療NAFLD。

長期高脂飲食會導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生炎癥因子，其中TNF-α可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[13,14]。IL-6是多種炎性疾病重要的炎癥介質(zhì)[15，16]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食會導(dǎo)致炎癥基因如TNF-α、IL-6等表達(dá)明顯上調(diào)，而虎杖苷對其有顯著的抑制作用。因此，虎杖苷可以抑制機體炎癥反應(yīng)，從而起到保護肝臟的作用。

胰島素抵抗是指機體組織對胰島素敏感性降低或胰島素信號傳導(dǎo)存在缺陷而導(dǎo)致機體對一定量的胰島素生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平的現(xiàn)象。早期研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)NAFLD患者存在胰島素抵抗[17-20]。本實驗結(jié)果表明，NAFLD模型大鼠血清血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)顯著性增加，胰島素敏感指數(shù)明顯降低，因此IR在NAFLD形成中起到了重要的作用。與模型組比較，虎杖苷C2、C3劑量組能顯著性降低胰島素抵抗指數(shù)，增加胰島素敏感指數(shù)，從病理上顯著性減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，表明虎杖苷能夠減輕NAFLD大鼠胰島素抵抗，增加胰島素敏感性。

肝細(xì)胞內(nèi)有兩組脂肪調(diào)控基因，分別為脂肪合成基因和脂肪酸氧化基因。肝細(xì)胞脂質(zhì)合成基因受孤核受體SREBP-1c的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c高表達(dá)使肝細(xì)胞脂肪酸合成增加，導(dǎo)致脂肪酸和三酰甘油在肝細(xì)胞內(nèi)堆積從而形成脂肪肝，抑制SREBP-1c下調(diào)脂質(zhì)合成基因的表達(dá)[21]。脂肪酸氧化基因受孤核受體PPAR-α的調(diào)控，PPAP-α的活化可上調(diào)脂肪酸氧化基因的表達(dá)。SREBP-1c對代謝的調(diào)控是通過多個轉(zhuǎn)錄子間的相互作用實現(xiàn)的，如LXR-α等。LXR-α在肝臟呈高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)LXR-α可被細(xì)胞內(nèi)升高的膽固醇水平活化，進而誘導(dǎo)一系列參與膽固醇吸收、轉(zhuǎn)運和分泌基因的表達(dá)[22]。本實驗研究結(jié)果表明，與對照組比較，模型組PPAR-α蛋白表達(dá)顯著性降低，LXR-α、SREBP-1c蛋白表達(dá)顯著性增加，因此，PPAR-α、LXR-α和SREBP-1c蛋白在NAFLD形成中發(fā)揮了重要作用。盡管虎杖苷各劑量組并不能上調(diào)PPAR-α的表達(dá)，但能下調(diào)LXR-α和SREBP-1c的表達(dá)，因此虎杖苷可能通過下調(diào)LXR-α表達(dá)，抑制其與RXR的結(jié)合，從而導(dǎo)致SREBP-1c基因表達(dá)下調(diào)。

綜上研究，虎杖苷可能是通過抗氧化作用、抑制脂質(zhì)過氧化，抑制機體炎癥反應(yīng)，降低胰島素抵抗，下調(diào)脂質(zhì)合成因子SREBP-1c和LXR-α蛋白的表達(dá)，減少脂質(zhì)合成等關(guān)鍵途徑來治療NAFLD。