鄧嘉強(qiáng)，鐘麗君，劉歡歡，曹隨忠，沈留紅，余樹(shù)民

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

視黃醇(維生素A)是一類(lèi)常見(jiàn)的脂溶性物質(zhì)，視黃醇及其主要衍生物是維持機(jī)體生命活動(dòng)、正常生理功能的必需化合物，具有促氧化和抗氧化的雙重效應(yīng)[1]。已有研究表明，視黃醇及其活性衍生物通過(guò)影響哺乳動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞(sertoli cell，SC)增殖發(fā)育和精原細(xì)胞減速分裂周期對(duì)雄性動(dòng)物精子發(fā)生和睪丸發(fā)育發(fā)揮重要調(diào)控作用[2-4]。視黃醇缺乏或過(guò)量，均會(huì)引起睪丸病變和精子發(fā)生障礙[4-5]。

支持細(xì)胞是睪丸曲細(xì)精管上皮的主要組成細(xì)胞，為發(fā)育中的雄性生殖細(xì)胞提供微環(huán)境和免疫保護(hù)功能[6-8]，支持細(xì)胞在調(diào)控睪丸發(fā)育[9]、精子發(fā)生[10]、精原干細(xì)胞(spermatogenial stem cells，SSCs)增殖和分化等過(guò)程中均具有不可或缺的作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，初情期前期睪丸支持細(xì)胞可以通過(guò)合成和分泌一系列細(xì)胞因子調(diào)節(jié)SSCs增殖和分化[13]，如膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurophic factor，GDNF)[14-15]、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)[16]、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)[17]、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF2)[18]等。支持細(xì)胞是睪丸內(nèi)視黃醇及其衍生物作用的最主要靶細(xì)胞，視黃醇通過(guò)支持細(xì)胞介導(dǎo)，在雄性動(dòng)物生殖功能中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8]，因此其常被選作研究視黃醇調(diào)節(jié)雄性動(dòng)物生殖功能的體細(xì)胞。目前對(duì)于視黃醇作用支持細(xì)胞的研究主要集中于裂齒動(dòng)物[2-3]，對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞生物學(xué)功能的研究較少。本試驗(yàn)在體外條件下添加視黃醇，通過(guò)分析支持細(xì)胞活性、增殖及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和分泌情況，評(píng)價(jià)視黃醇對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞的體外生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步闡明視黃醇在支持細(xì)胞內(nèi)的代謝，以及視黃醇通過(guò)支持細(xì)胞介導(dǎo)調(diào)控雄性動(dòng)物生殖機(jī)能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3～5周齡仔豬睪丸樣品取自于雅安某規(guī)?；i場(chǎng)。

CCK-8試劑盒，日本Dojindo Laboratories公司；Cell AmpTMDirect RNA prep Kit for Real Time RT-PCR，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；全反式視黃醇，美國(guó)Sigma公司；FBS和DMEM高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；IV型膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和DNase I酶，美國(guó)Amresco公司；高純總RNA快速提取試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit和Premix TaqTM，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；ELISA試劑盒，美國(guó)Rapidbio公司。

1.2 方法

1.2.1 仔豬睪丸支持細(xì)胞的分離純化

無(wú)菌采集仔豬睪丸，置于無(wú)菌PBS中，75%酒精浸泡3 min，去除附睪和白膜后，取實(shí)質(zhì)剪成l～2 mm3大小。參照文獻(xiàn)[19]，剪碎的組織先用0.25% IV型膠原酶和0.1%透明質(zhì)酸酶共同消化60 min，再用0.25%胰蛋白酶和0.1% DNase I共同消化20 min，經(jīng)過(guò)濾、離心和洗滌后，將細(xì)胞沉淀用含10% FBS的DMEM重新懸浮。最終以(0.5～1)×106cells·mL-1接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)2 h后，收集懸液接種培養(yǎng)5～6 h，移除懸浮細(xì)胞，用20 mmol Tris-HCl處理5 min，洗滌后添加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)支持細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以(6～8)×104cells·mL-1接種于96孔板，每孔100 μL，過(guò)夜培養(yǎng)后更換培養(yǎng)液，分別添加濃度為0、0.005、0.025、0.125、0.625、1.250、2.500、5.000和10.000 μmol·L-1的視黃醇，不添加視黃醇的作為空白對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h和72 h后分別用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力，以培養(yǎng)72 h后顯著抑制細(xì)胞活性的視黃醇最小濃度繪制支持細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)支持細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期支持細(xì)胞，以(6～8)×104cells·mL-1接種于96孔板，每孔100 μL，過(guò)夜培養(yǎng)后更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組添加1.250 μmol·L-1視黃醇，對(duì)照組(C)不做任何處理，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在培養(yǎng)12 h、3 d和5 d后分別抽提細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增后，進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)凝膠成象儀成象，分析細(xì)胞增殖相關(guān)基因(PCNA、C-MYC和BCL-2)和凋亡相關(guān)基因(CASP3和BAX)表達(dá)情況。PCR引物序列參見(jiàn)表1，凝膠成像結(jié)果用Image J進(jìn)行灰度值分析，用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化蛋白表達(dá)量，以目的基因灰度值與GAPDH的灰度值比值作為其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 支持細(xì)胞中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄與合成檢測(cè)

獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期支持細(xì)胞，以2×105cells·mL-1接種于96孔板。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含10%FBS)中培養(yǎng)2 d，更換含5% FBS培養(yǎng)液，對(duì)照組(C)不添加視黃醇，試驗(yàn)組添加1.25 μmol·L-1視黃醇，分別于培養(yǎng)24 h和72 h后取樣，每組3個(gè)重復(fù)，對(duì)基因GDNF、LIF、CSF-1、FGF2、EGF、GAPDH的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測(cè)。

表1 基因引物參數(shù)

Table1Primer parameters of genes

基因gene引物Primer5′→3′序列Sequences (5′→3′)Tm產(chǎn)物Product/bpPCNAPCNA-FTTCTTTCTTCCACCTGTAGC56470PCNA-RCACCAGAAGGCATCTTTACTBCL-2BCL-2-FCTTTGCCGAGATGTCCAGC58197BCL-2-RTCCACAGGGCGATGTTGTCBAXBAX-FGCCGAAATGTTTGCTGAC57170BAX-RGCCGATCTCGAAGGAAGC-MYCC-MYC-FTCATCAAAAACATTATCATCCA58235C-MYC-RCTGTCGTTGAGCGGGTAGCASP3CASP3-FTTGGAACAAATGGACCTG56146CASP3-RACTGACCGTCTCAATCCCGDNFGDNF-FCCTTGTGTTGAGGAACAG57204GDNF-RTCCTGGGCAAACATTTGCLIFLIF-FTCACTCCTGTCAATGCCACC57261LIF-RCCAAGGTAGGCGATGATGCCSF-1CSF-1-FGAGGTGTCGGAGAACTGTAGC58220CSF-1-RTGGCATTGGGAGTGTTGTCFGF2FGF2-FGAAGAGCGACCCTCACATCAA58219FGF2-RCAGTGCCACATACCAACTGGAEGFEGF-FATGCTGCTCTTCCTTATCCT55274EGF-RCGACCCAATAGATTCTTTCCGAPDHGAPDH-FTCGGAGTGAACGGATTTG56219GAPDH-RCCTGGAAGATGGTGATGG

分別收集細(xì)胞樣品和細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)3 500 r·min-1離心20 min，吸取上清液分裝于2 mL凍存管內(nèi)，-80 ℃凍存。細(xì)胞樣品經(jīng)消化、離心及洗滌后，將細(xì)胞沉淀用PBS重懸至密度為5×105cells·mL-1，通過(guò)反復(fù)凍融過(guò)程破壞細(xì)胞膜，從而釋放胞內(nèi)物質(zhì)，再經(jīng)3 500 r·min-1離心20 min，收集上清，置于-80 ℃凍存。ELISA法分別檢測(cè)細(xì)胞樣品和培養(yǎng)液樣品中GDNF、FGF2、CSF-1、LIF和EGF的含量，用新鮮的高糖DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照(C)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每次試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過(guò)軟件SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 支持細(xì)胞的分離純化

原代支持細(xì)胞開(kāi)始貼壁時(shí)多呈無(wú)規(guī)則多角形(圖1-a)，當(dāng)培養(yǎng)至相鄰細(xì)胞融合成片時(shí)，進(jìn)行傳代；第1、3代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)初期細(xì)胞呈短梭型(圖1-b、c)；傳至第5代，細(xì)胞出現(xiàn)老化，增殖速度變慢，胞內(nèi)可見(jiàn)空泡或顆粒(圖1-d)。

2.2 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞體外活性影響

如圖2所示，當(dāng)視黃醇添加濃度小于5.000 μmol·L-1時(shí)，培養(yǎng)24 h的細(xì)胞活性與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，而濃度達(dá)到5.000 μmol·L-1及以上時(shí)細(xì)胞活性受到顯著抑制(P<0.05)；當(dāng)視黃醇添加濃度高于0.125 μmol·L-1時(shí)，對(duì)培養(yǎng)3 d的支持細(xì)胞活性呈現(xiàn)顯著抑制(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依耐性，當(dāng)濃度達(dá)到1.250 μmol·L-1時(shí)表現(xiàn)極顯著抑制(P<0.01)。

a～d分別為原代、第1、3、5代分別培養(yǎng)至第2天的支持細(xì)胞。a-d represented the primary cells， P1， P3 and P5 represented sertoli cells cultured for 2 d.圖1 仔豬睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)Fig.1 Isolation and culture of sertoli cells

a、b分別為細(xì)胞培養(yǎng)24 h和3 d后細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果。*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，* *表示與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。下圖同。a and b represented cell viability assay results after 24 h and 3 d. * represented significant difference at P<0.05， * * represented significant difference at P<0.01. The same as below.圖2 視黃醇對(duì)睪丸支持細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of retinol on sertoli cell viability of testicular

以1.250 μmol·L-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)視黃醇添加濃度，該濃度下支持細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖3所示，視黃醇添加組和對(duì)照組生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，0～2 d為潛伏期，3 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7 d后進(jìn)入平臺(tái)期。結(jié)果表明，視黃醇對(duì)支持細(xì)胞活性具有抑制作用，且這種抑制作用具有時(shí)效性和劑量依賴(lài)性。

2.3 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組相比，視黃醇添加組支持細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(圖4)。12 h時(shí)視黃醇添加組PCNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，而12 h后，視黃醇組PCNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)；視黃醇添加組CASP3的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；視黃醇添加組C-MYC相對(duì)表達(dá)量在3 d和5 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；視黃醇組BCL-2相對(duì)表達(dá)量在各個(gè)時(shí)期均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；視黃醇組BAX相對(duì)表達(dá)量5 d時(shí)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明，添加視黃醇可以顯著下調(diào)支持細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)基因(PCNA、BCL-2和C-MYC)表達(dá)，上調(diào)凋亡相關(guān)基因(BAX和CASP3)表達(dá)。

圖3 支持細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3 Growth curve of sertoli cells

2.4 視黃醇對(duì)支持細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響

收集添加視黃醇干預(yù)培養(yǎng)24 h和3 d后的支持細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和ELISA檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果顯示，GDNF、CSF-1、EGF、LIF和FGF2在支持細(xì)胞中均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)(圖5)。與對(duì)照組相比，視黃醇添加組支持細(xì)胞GDNF和CSF-1的基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；EGF的基因表達(dá)量在培養(yǎng)3 d時(shí)顯著下調(diào)(P<0.05)，在培養(yǎng)24 h時(shí)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。視黃醇添加對(duì)支持細(xì)胞內(nèi)LIF和FGF2的基因表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明(表2)，處理24 h時(shí)，視黃醇添加組細(xì)胞中GDNF含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，CSF-1、EGF含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；處理3 d，視黃醇添加組細(xì)胞中CSF-1、FGF2含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，GDNF、EGF含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。綜上所述，視黃醇可以顯著抑制GDNF、CSF-1和EGF的轉(zhuǎn)錄和合成。

a為目的基因電泳圖；b～f分別為PCNA、CASP3、C-MYC、BCL-2和BAX基因的相對(duì)表達(dá)量。a represented the expression of target genes; b-f represented relative expression levels of PCNA， CASP3， C-MYC， BCL-2 and BAX.圖4 支持細(xì)胞內(nèi)增殖和凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of proliferation and appotis related genes in sertoli cells

3 討論

視黃醇是最早發(fā)現(xiàn)的維生素之一，在機(jī)體生殖功能和免疫功能調(diào)節(jié)中都具有不可或缺的作用[1]，但大量的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，視黃醇對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用[20-23]。支持細(xì)胞是機(jī)體生殖功能調(diào)節(jié)的主要功能細(xì)胞[8]，機(jī)體內(nèi)支持細(xì)胞中視黃醇的生理水平維持在0.2～5.0 μmol·L-1之間[24-25]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)血清的體外培養(yǎng)條件下，添加高濃度的視黃醇，會(huì)對(duì)睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，但由于細(xì)胞的獲取、來(lái)源、培養(yǎng)條件和視黃醇作用時(shí)間的不同，導(dǎo)致視黃醇對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)功能影響呈現(xiàn)一定的差異。Oliveira等[22]發(fā)現(xiàn)，添加7 μmol·L-1視黃醇24 h后，大鼠睪丸支持細(xì)胞中超氧化物產(chǎn)生，并且使細(xì)胞發(fā)生形變，甚至?xí)鸺?xì)胞DNA損傷[20]。Gelain等[21]發(fā)現(xiàn)，視黃醇添加濃度高于5 μmol·L-1時(shí)，對(duì)培養(yǎng)24 h后的大鼠睪丸支持細(xì)胞具有促氧化作用；當(dāng)濃度達(dá)到14 μmol·L-1時(shí)，支持細(xì)胞活性受到顯著抑制。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在含6% FBS的體外培養(yǎng)條件下，低劑量的視黃醇(2～5 μmol·L-1)處理6 h后誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞系DNA損傷[23]。上述研究均顯示，體外條件下添加視黃醇可以誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷。DNA損傷是自發(fā)產(chǎn)生的過(guò)程，可被環(huán)境中的誘變因素加強(qiáng)，進(jìn)一步干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而導(dǎo)致細(xì)胞活性喪失，多細(xì)胞生物會(huì)對(duì)該過(guò)程做出選擇，使細(xì)胞程序性死亡[26]。在本試驗(yàn)中，在含10%FBS的體外條件下，添加視黃醇對(duì)支持細(xì)胞活性具有顯著抑制作用，并且呈現(xiàn)時(shí)效性和劑量依賴(lài)性，增殖相關(guān)基因PCNA、BCL-2和C-MYC顯著下調(diào)，凋亡相關(guān)基因BAX顯著上調(diào)，這可能是視黃醇誘導(dǎo)了支持細(xì)胞DNA損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

a為目的基因電泳圖；b～f分別為GDNF、LIF、CSF-1、FGF2和EGF基因的相對(duì)表達(dá)量。a represented the expression of target genes; b-f represented relative expression levels of GDNF、LIF、CSF-1、FGF2 and EGF.圖5 支持細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of cytokines related genes in sertoli cells

表2ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子濃度

Table2Concentration of cytokines detected by ELISA

細(xì)胞因子cytokinest/d細(xì)胞內(nèi)濃度Concentration in cells/(ng·L-1)對(duì)照組 Control group處理組 Treatment group基質(zhì)中濃度Concentration in medium/(ng·L-1)對(duì)照組 Control group處理組 Treatment groupGDNF11 333.67±182.16 aA825.67±104.00 bA3 963.67±96.46 aA3 131.00±166.28 bB32 840.33±107.71 aA1949.67±135.21 bB689.67±141.20 aA464.33±160.38 bBLIF1782.21±34.70 aA703.77±118.13 aA771.14±33.96 aA476.90±71.70 bA3794.92±10.17 aA671.66±32.00 aA672.58±27.75 aA604.57±119.37 aACSF-11551.76±8.67 aA399.29±12.51 bB517.52±17.79 aA395.46±25.10 bB3412.01±4.42 aA387.26±10.22 bA378.18±1.95 aA357.17±9.11 aAFGF21341.33±21.37 aA312.73±9.51 aA228.837±9.61 aA220.217±13.63 aA3435.89±27.67 aA353.94±19.55 bA225.87±22.48 aA216.713±20.90 aAEGF11 564.41±69.40 aA1 140.88±48.94 bB1 366.95±179.61 aA953.79±51.21 bA31 683.18±26.06 aA1 343.32±64.01 bB1 278.49±66.22 aA1 342.47±72.68 aA

同行數(shù)據(jù)后無(wú)相同大、小寫(xiě)字母的分別表示組內(nèi)差異極顯著(P<0.01)與顯著(P<0.05)。

In the same row， data marked without the same uppercase or lowercase letters indicated significant differences atP<0.01 andP<0.05， respectively.

強(qiáng)大分泌功能是支持細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要途徑之一，Marh等[27]將小鼠精母細(xì)胞與支持細(xì)胞的共培養(yǎng)，可以使早期的生殖細(xì)胞產(chǎn)生具有受精能力的精子，間接證明支持細(xì)胞在生殖細(xì)胞增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)對(duì)支持細(xì)胞中相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，GDNF、LIF、CSF-1、FGF2和EGF在支持細(xì)胞中均有轉(zhuǎn)錄和合成，這些細(xì)胞因子是支持細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控功能的重要基礎(chǔ)[14-16,18,28]，添加視黃醇對(duì)GDNF、CSF-1和EGF的轉(zhuǎn)錄和合成具有顯著抑制作用，說(shuō)明添加視黃醇對(duì)支持細(xì)胞的分泌功能起抑制作用，這可能是該視黃醇濃度下引起支持細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，從而使細(xì)胞分泌功能減弱，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

本試驗(yàn)結(jié)果豐富了視黃醇對(duì)哺乳動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞體外生物學(xué)特性影響這一領(lǐng)域的研究，進(jìn)一步闡明視黃醇在支持細(xì)胞內(nèi)代謝機(jī)理，以及為視黃醇作用于支持細(xì)胞后對(duì)雄性動(dòng)物生殖功能的影響提供了理論依據(jù)。