余菁 許輝 劉芝翠 馬越娥 史玉玲

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072

在常規(guī)的真菌直接鏡檢中，最常用的浮載液是10%～20%KOH，但因其背景雜亂，菌絲及孢子與脂滴、氣泡、雜質(zhì)等不易分辨，當(dāng)菌量較少或只有少量孢子時(shí)，容易漏診。熒光染色法用于真菌檢測時(shí)，染料能與真菌細(xì)胞壁的纖維素和幾丁質(zhì)特異性結(jié)合而使菌體著色，真菌（菌絲和孢子）在鏡下為清晰的亮藍(lán)色，而組織呈淡藍(lán)色，背景為暗色，菌絲的橫隔結(jié)構(gòu)和孢子的出芽形態(tài)清晰可見，易于識別。本研究收集600 例臨床擬診為淺部真菌感染、102例擬診為馬拉色菌感染的病例，通過對比熒光染色法和KOH 濕片法檢出陽性率和閱片時(shí)間，驗(yàn)證熒光染色法診斷淺部真菌感染的優(yōu)越性。

材料與方法

1.標(biāo)本來源：2017年7月至2018年2月期間到同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科就診、臨床擬診為真菌感染的淺部真菌病患者600例，其中擬診為手癬 47 例，足癬 146 例，體股癬 212 例，甲真菌病187 例。另收集擬診為馬拉色菌感染患者102 例，包括花斑糠疹54 例，馬拉色菌毛囊炎48 例。見表1。

2.試劑與儀器：熒光染色液（包含熒光素、KOH、復(fù)染劑，江蘇萊芙時(shí)代生物科技公司）；10%KOH 溶液自配；奧林巴斯CX21 顯微鏡（增加熒光模塊，日本奧林巴斯公司）；沙氏培養(yǎng)基（海科馬嘉微生物技術(shù)有限公司）。

表1 600例擬診手足癬、體股癬、甲真菌病及102例擬診馬拉色菌感染患者標(biāo)本真菌檢測陽性率比較［陽性例數(shù)（%）］

3.標(biāo)本采集：①毛發(fā)標(biāo)本采集：選擇8 例病損處、毛囊口折斷的毛發(fā)，用鑷子將毛發(fā)從頭皮拔出，盡量保留毛根部；②皮屑標(biāo)本采集：鈍刀片刮取皮損炎性活動性邊緣的鱗屑；③甲標(biāo)本采集：鈍刀從甲變色、萎縮或變脆的部位、健甲與病甲的交界處取材，保證一定深度，最好能達(dá)到甲板腹側(cè)；④毛囊炎標(biāo)本采集：用無菌鈍刀的尖端挑破膿皰頂端，向內(nèi)擠壓取出毛囊內(nèi)乳酪狀內(nèi)容物，將標(biāo)本置于載玻片上。

4.直接鏡檢及培養(yǎng)：將同一患者同一部位取得的標(biāo)本隨機(jī)分為3份，其中2份分別用KOH濕片法和熒光染色法由同一檢測員進(jìn)行直接鏡檢，以高倍鏡下觀察到菌絲或孢子判定為陽性，開始觀察時(shí)計(jì)時(shí)，記錄閱片時(shí)間（鏡檢陰性不計(jì)時(shí)）。將另1份標(biāo)本接種在沙堡弱培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)2周，根據(jù)形態(tài)學(xué)及生化反應(yīng)鑒定有無真菌生長及菌種（馬拉色菌標(biāo)本不進(jìn)行培養(yǎng)）。

5.熒光染色法與KOH 濕片法檢測：對600 例擬診為淺部真菌感染標(biāo)本及按其來源（皮屑、甲、毛發(fā)），分別比較其檢出陽性率及平均閱片時(shí)間。對擬診為馬拉色菌感染的54 例花斑糠疹標(biāo)本，48 例馬拉色菌毛囊炎標(biāo)本分別比較兩種方法檢出陽性率及平均閱片時(shí)間。以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)比較兩種方法的漏診情況。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，對于計(jì)數(shù)資料，理論數(shù)≥5 且總樣本量≥40 時(shí)采用卡方檢驗(yàn)；1 ≤理論數(shù)＜5且總樣本量≥40時(shí)采用連續(xù)性校正的卡方檢驗(yàn)；理論數(shù)＜1或總樣本量＜40時(shí)采用Fisher精確檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用配對設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.鏡下表現(xiàn)：熒光染色后，真菌（菌絲和孢子）被熒光標(biāo)記，在鏡下可見亮藍(lán)色真菌輪廓（圖1）。而KOH 濕片法鏡下背景雜亂，菌絲及孢子呈無色透明或淡綠色折光，與背景反差小，與脂滴、氣泡、雜質(zhì)等不易分辨，馬拉色菌毛囊炎標(biāo)本還可見大量脂滴與孢子混雜，不易辨別（圖1）。

2.兩種方法檢測淺部真菌的陽性率：600 份標(biāo)本中，熒光染色法與KOH 濕片法檢出陽性分別為546份（91.00%）、489份（81.50%），陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 22.83，P＜ 0.05）。其中，皮屑標(biāo)本405份，熒光染色法和KOH濕片法檢出陽性數(shù)分別為380份（93.83%）、348份（85.93%），陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 13.89，P＜ 0.05）；甲標(biāo)本187 份，檢出陽性數(shù)分別為 159 份（85.03%）、136 份（72.73%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 8.49，P＜0.05）。毛發(fā)標(biāo)本8份，分別檢出7份和5份陽性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.57）。

圖1 淺部真菌感染患者標(biāo)本熒光染色法和KOH 濕片法檢測的效果比較 熒光染色后，真菌菌絲和孢子被熒光標(biāo)記，見亮藍(lán)色真菌輪廓。而KOH濕片法鏡下背景雜亂，菌絲及孢子呈無色透明或淡綠色折光，與背景反差小，與脂滴、氣泡、雜質(zhì)等不易分辨；馬拉色菌毛囊炎標(biāo)本還可見大量脂滴與孢子混雜

3.兩種方法檢測皮屑來源標(biāo)本的陽性率比較：405例皮屑標(biāo)本，主要來源于臨床擬診為手足癬和體股癬患者。手癬47 例，熒光染色法和KOH 濕片法陽性率分別為87.23%、70.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。足癬146例，陽性率分別為92.47%、82.19%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。體股癬212例，陽性率分別為96.23%、91.98%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1。

4.兩種方法檢測甲來源標(biāo)本的陽性率比較：熒光染色法和KOH濕片法檢測甲標(biāo)本187例，遠(yuǎn)端側(cè)位甲下型69 例，陽性率分別為86.96%、71.01%（P＜ 0.05）；近端甲下型 24 例，陽性率分別為58.33%、50.00%（P＞ 0.05），全甲毀損型51例，檢出陽性率分別為88.24%、70.59%（P＜ 0.05）；白色淺表型 43 例，陽性率分別為 93.02%、90.70%（P＞0.05）。見表1。

5.兩種方法檢測馬拉色菌感染標(biāo)本的陽性率比較：102 例擬診為馬拉色菌感染患者的標(biāo)本中，熒光染色法與KOH 濕片法的檢測陽性率分別為92.16%、59.80%（P＜ 0.05），對花斑糠疹的檢出陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對馬拉色菌毛囊炎標(biāo)本檢出陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

6.兩種檢測方法閱片時(shí)間比較：600 份淺部真菌標(biāo)本，熒光染色法與KOH 濕片法閱片時(shí)間分別為（73.67 ± 13.56）s、（87.12 ± 15.83）s（t= 14.60，P＜ 0.05）。54 份花斑糠疹標(biāo)本分別為（38.36 ±8.79）s、（41.25 ± 15.67）s（t= 1.14，P＞ 0.05）。48份馬拉色菌毛囊炎標(biāo)本分別為（42.14 ± 12.61）s、（103.56 ± 9.48）s（t=17.83，P＜ 0.05）。

7.培養(yǎng)結(jié)果及兩種方法漏診的比較：在600例標(biāo)本中，479 例培養(yǎng)陽性，手癬 37 例，足癬 114 例，體股癬198例，甲真菌病127例，毛發(fā)3例。檢出菌種包括紅色毛癬菌302 例、犬小孢子菌43 例、石膏樣小孢子菌32例、須癬毛癬菌36例、絮狀表皮癬菌13例、白念珠菌52例、斷發(fā)毛癬菌1例。培養(yǎng)陽性的479 例中，熒光染色法陽性476 例，陰性3 例（0.63%）；KOH 濕片法陽性 465 例，陰性 14 例（2.92%），兩種方法檢測漏診率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.25，P＜ 0.05）。熒光染色法靈敏度99.37%，特異度42.15%；KOH濕片法靈敏度97.28%，特異度80.17%。見表2。

表2 600例淺部真菌感染患者培養(yǎng)結(jié)果及熒光染色法和KOH濕片法檢測效果比較（例）

討 論

淺部真菌病是各類感染性皮膚病中常見病和多發(fā)病。直接鏡檢法是淺部真菌形態(tài)學(xué)檢查的基本方法［1］。KOH 濕片法是臨床上直接鏡檢使用最早、最廣的方法，該法操作簡單、快捷，不需要特殊儀器。但缺點(diǎn)亦明顯，例如背景雜亂、檢出率偏低，該缺點(diǎn)在檢測甲標(biāo)本、馬拉色菌毛囊炎尤為明顯，且孢子類結(jié)構(gòu)易與氣泡、脂滴混淆。熒光染色液是一種高純度熒光素和特定比例KOH 的復(fù)合溶液，熒光素標(biāo)記的幾丁質(zhì)重組酶能與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)特異性結(jié)合，形成強(qiáng)熒光復(fù)合物，使真菌結(jié)構(gòu)發(fā)出亮藍(lán)色的熒光。該方法容易掌握，操作方法與KOH 濕片法一致，且無需加熱，耗時(shí)短，結(jié)果直觀，同時(shí)也彌補(bǔ)了KOH濕片法對疑難標(biāo)本（菌量少的標(biāo)本、材質(zhì)厚的甲屑標(biāo)本、僅有孢子的標(biāo)本、外涂藥膏的標(biāo)本等）易出現(xiàn)假陰性的缺點(diǎn)。特別是對于馬拉色菌毛囊炎標(biāo)本，熒光染色法不標(biāo)記脂滴，易于分辨脂滴和孢子。值得注意的是，熒光染色法也能標(biāo)記植物纖維素，空氣和玻片上存在的少量纖維，在熒光顯微鏡下也可發(fā)出熒光，但纖維形態(tài)一般不規(guī)則，大小、粗細(xì)、亮度等都與真菌有很大差異，沒有典型的真菌橫隔和出芽結(jié)構(gòu)，憑經(jīng)驗(yàn)一般可以避免假陽性情況的發(fā)生。［2-5］

我們通過對比熒光染色法和KOH濕片法檢測門診收集的擬診為淺部真菌感染標(biāo)本的檢出陽性率，發(fā)現(xiàn)熒光染色法陽性率明顯高于KOH濕片法，且閱片時(shí)間明顯低于KOH濕片法。根據(jù)標(biāo)本來源細(xì)分，皮屑、甲標(biāo)本熒光染色的陽性率均高于KOH法，研究結(jié)果與既往類似報(bào)道一致［6-8］。兩種方法對毛發(fā)標(biāo)本的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由于毛發(fā)標(biāo)本僅8例，可能會影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

本研究皮屑標(biāo)本主要來自擬診為體股癬和手足癬的患者，兩種方法對來自體股癬皮屑檢出陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由于體股癬患者皮屑角質(zhì)較薄，雜質(zhì)較少，鏡下菌絲在KOH 濕片中也較易辨認(rèn)。兩種方法對手癬水皰鱗屑型檢出陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而角化增厚型檢出陽性率有明顯差異，對足癬角化過度型檢出陽性率有明顯差異。當(dāng)皮屑角質(zhì)較厚時(shí)，KOH不易溶解角質(zhì)使之透明，組織與真菌不易分離，檢出較困難，且角化型手足癬一般出現(xiàn)濕疹化，皮屑中菌量較少，容易遺漏，而熒光染色標(biāo)本對比明顯，不易漏診。

對于甲來源標(biāo)本，兩種方法對遠(yuǎn)端側(cè)位甲下型和全甲毀損型檢出陽性率有明顯差異，而近端甲下型和白色淺表型檢出陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮近端側(cè)位甲下型因其病變在甲下，用鈍刀刮取時(shí)不易取到病變部位甲屑，使兩種方法陽性率均偏低。胡記妹等［9］發(fā)現(xiàn)用浸軟法可提高甲標(biāo)本鏡檢陽性率。白色淺表型因病變部位較淺，刮取的標(biāo)本一般菌量較多、雜質(zhì)較少，兩種方法陽性率均較高。而遠(yuǎn)端側(cè)位甲下型和全甲毀損型指（趾）甲增厚，KOH不易溶解，呈灰黃或灰褐色，雜質(zhì)較多，鏡下雜亂，不易分辨，而熒光染色法鏡下除真菌為亮藍(lán)色，組織細(xì)胞為淡藍(lán)色，其他雜質(zhì)均不染色，能明顯提高檢出陽性率。已有文獻(xiàn)報(bào)道熒光染色法在甲真菌病檢測中的應(yīng)用價(jià)值［10-11］。

馬拉色菌主要定植于頭、面、頸、肩、胸、背等部位，是一種嗜脂性酵母菌，與多種皮膚疾病如花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎、特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎、銀屑病等有關(guān)［12］。本研究兩種方法對馬拉色菌檢出陽性率分別為92.16%、59.80%，高于派克墨水（84.44%）［13］和芝加哥天藍(lán)（68.68%）［14］，但由于標(biāo)本選擇和操作人員不同，熒光染色和其他染色方法的對比還有待進(jìn)一步研究。我們采用兩種方法檢測花斑糠疹標(biāo)本的陽性率和閱片時(shí)間結(jié)果無顯著性差異，而馬拉色菌毛囊炎有顯著差異?？紤]主要是由于花斑糠疹患者選取典型病例，鏡下呈葡萄狀分布的圓形、卵圓形孢子和短粗、兩頭鈍圓的臘腸形菌絲的典型形態(tài)特征在KOH 涂片中也清晰易辨，而只表現(xiàn)為孢子形態(tài)的馬拉色菌毛囊炎采用KOH 法鏡檢時(shí)，其孢子混于角栓之中，易與散在、圓形、暗綠色、反光的脂肪滴混淆，很難準(zhǔn)確查出陽性孢子，而用熒光染色后孢子呈亮藍(lán)色，脂滴、氣泡均不著色，對比明顯，可提高馬拉色菌檢出的準(zhǔn)確性和速度。Ramos 等［15］也發(fā)現(xiàn)熒光增白劑能提高馬拉色菌鏡檢陽性率。

綜上所述，對于淺部真菌感染的直接鏡檢，熒光染色法檢出陽性率和閱片時(shí)間均優(yōu)于KOH濕片法，特別是對于角質(zhì)較厚、菌量較少、僅有孢子或雜質(zhì)較多的標(biāo)本，熒光染色法更快速、簡便，陽性率更高，漏診更少。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突