馬 龍，王海月，周 津，曹秀琪

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

惡性腫瘤已成為威脅人類健康的頭號殺手．研究[1]估計，2018年全球范圍內(nèi)將會有1810萬癌癥新增病例和960萬癌癥死亡病例，并且預計癌癥將成為21世紀世界上每個國家人民的主要死亡原因和提高壽命最重要的障礙．因此，研究癌癥成因和發(fā)展機制，找到高效合理的預防和治療手段，是醫(yī)藥工作者的重大命題．雖然人類已經(jīng)取得了一定進展，有不少有效的藥物被應用于臨床，但是找到新的藥物靶點，使藥物能夠選擇性的殺滅癌細胞，降低藥物對正常細胞的毒副作用和防止癌癥復發(fā)，仍是抗癌藥物研發(fā)所面臨的巨大挑戰(zhàn)．

不少的抗癌藥物都是通過引起過度的 DNA損傷來抑制癌癥[2]，因此癌細胞已經(jīng)進化出高效、保守的 DNA修復系統(tǒng)，以防止內(nèi)源和外源 DNA損傷．然而當特異性 DNA修復酶含量增加時，可以提高腫瘤細胞對抗癌藥物的抗性[3]，因此人皮瓣內(nèi)切酶1(human flap endonuclease 1，F(xiàn)EN1)作為一種結構特異型的5′-核酸酶，因其在DNA復制和修復中的重要作用引起了研究者的注意．研究[4]顯示，使用 FEN1抑制劑可以直接殺死癌細胞或者增敏某些 DNA損傷劑(DNA damaging agent)．FEN1還可以通過涉及“合成致死性”的機制選擇性殺死癌細胞．因此，在基于遺傳和組合抗癌治療模式中，開發(fā)功能有效的小分子FEN1抑制劑以降低FEN1的活性，在開發(fā)靶向抗腫瘤藥物中具有重要意義．

1 FEN1的生物學功能和作用機制

FEN1能夠特異性地切除在DNA聚合酶催化的DNA鏈置換合成過程中產(chǎn)生的 5′端單鏈 DNA或者RNA[5]．FEN1是一種結構特異型核酸酶，需要二價金屬離子才能發(fā)揮催化作用[6]．FEN1是真核生物后隨鏈復制(lagging-strand DNA replication)、長補丁堿基切除修復(long-patch base excision repair，LP-BER)以及核苷酸切除修復(nucleotide excision repair，NER)中不可或缺的重要酶[7]．另外，F(xiàn)EN1還在維持端粒穩(wěn)定性、重啟停滯的復制叉、DNA碎片化和處理三核苷酸串聯(lián)重復結構(trinucleotide repeat expansion，TRN)上起重要作用[8]．研究[9]表明，F(xiàn)EN1主要有維持端粒穩(wěn)定、進行堿基和核苷酸切除修復以及促進岡崎片段成熟的功能．在DNA復制和修復中，F(xiàn)EN1和PCNA(proliferating cell nuclear antigen)相互作用形成“滑行夾”，然后去完成核酸切割任務[10]. 在DNA堿基切除修復中，一分子的 FEN1和一分子的APE1(human AP endonuclease)相結合，APE1協(xié)同F(xiàn)EN1作用并增強其活性[11]．在維持端粒穩(wěn)定性方面，F(xiàn)EN1和端粒酶形成復合物，并在端粒酶介導的端粒穩(wěn)定性上發(fā)揮作用[12]．在酶學機制上，F(xiàn)EN1的底物DNA中未能配對的5′-單鏈部分，通過一種“雜亂-穿孔-有序”(disorder-thread-order)的機制穿過FEN1的螺旋狀門道結構(helical arch)．并且 FEN1通過一種“去堿基配對化(unparing)”的機制去定位切割位點，以便進行正確的切割[13-15]．底物 DNA 的5′末端的單鏈部分穿過僅能夠容納單鏈 DNA的螺旋狀門道結構，而其雙鏈部分不能穿過，所以不能接觸到酶的活性口袋(圖 1[6])．在 5′端的單鏈區(qū)穿過螺旋狀門道結構后，F(xiàn)EN1將+1和-1堿基(+1和-1代表 FEN1切割的磷酸二酯鍵所連接的兩個堿基，+1在 5′端，-1在 3′端)和原來互補鏈的配對堿基分離，伸向酶的活性中心，這樣就只有應該被剪切的磷酸二酯鍵才能夠和活性中心的氨基酸殘基接觸，接近兩個二價金屬陽離子，以完成DNA切割(圖2[6])．這兩種機制使得FEN1擁有結構特異性的DNA切割能力，并且發(fā)現(xiàn)了活性中心的Y40、R93、R100對FEN1的活性和作用有巨大影響，在底物切割特異性上發(fā)揮重要作用．單分子熒光能量共振轉移實驗(Singlemolecule fluorescence resonance energy transfer)以及生物物理學研究顯示，F(xiàn)EN1應用誘導契合模型(induced-fit)來完成底物的特異性選擇[16]．正是FEN1的這種精準、特異的 DNA底物切割機制保證了基因組的穩(wěn)定性[17]．

圖1FEN1和底物 DNA復合物的晶體結構和結構功能單元Fig. 1 Crystal structure and functional components of FEN1 and substrate DNA complexes

圖2 FEN1與底物切割模式Fig. 2 Cleavage pattern of FEN1

2 FEN1在癌癥中的作用

鑒于 FEN1在維持基因組完整性方面發(fā)揮著至關重要的作用，并且其在多種癌癥類型中過度表達，因此它可能作為一種腫瘤治療靶點[18-19]．在 FEN1與腫瘤相關性的方面有不少的報道：(1)其在前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、神經(jīng)母細胞瘤等腫瘤細胞中高表達[20-23]；(2)可作為乳腺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤的生物標志物，而且可以增加肺癌、胃腸癌的易感性[24-28]；(3)FEN1的高表達與腫瘤病人的低生存率密切相關，同時還與進行前列腺切除術的前列腺癌病人的不良預后正相關[22,25,29-30]；(4)敲低 FEN1有抑制 RAD54B突變的人結直腸癌細胞、抑制人前列腺癌細胞的生長以及增敏曲妥珠單抗的作用，增強膠質瘤細胞對替莫唑胺和順鉑的敏感度；(5)紫杉醇聯(lián)合FEN1抑制劑對宮頸癌細胞具有協(xié)同抗腫瘤作用[31]. 因此，抑制FEN1可起到抑制腫瘤細胞的作用[22,32-37].

3 從合成致死角度探索 FEN1抑制劑抗腫瘤的思路

新的抗腫瘤藥物開發(fā)原理被不斷提出，美國科學家Lee Hartwell和Stephen Friend最早提出了將合成致死性概念用于癌癥的治療[38]．所謂合成致死，簡單地說就是指在兩個非致死基因中，若僅其中的一個基因發(fā)生了變異，細胞仍會存活，若兩個基因同時發(fā)生變異，則將引起細胞死亡，這兩個基因則構成合成致死搭檔(partner)．合成致死策略為尋找抗癌的新靶點提供了全新的思路．癌細胞由于其基因缺陷使它們在合成致死性面前變得更脆弱，這種腫瘤特異性缺陷正好可以被用來研發(fā)靶向藥物[39-40]．比如，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中某個基因失活或者用藥物抑制某個基因，與之構成合成致死搭檔的另外的一個基因就有可能成為潛在的“靶基因”，那么針對這個“靶基因”的抑制劑就能夠特異性的殺死癌細胞，并且不會影響正常細胞的存活(圖 3和圖 4)．總之，合成性致死方法是利用腫瘤細胞和正常細胞間的基因差異來最大化地發(fā)揮對癌細胞的殺滅作用，同時將對正常細胞的副作用最小化．因此，合成致死方法針對了不同的基因型，從而可以為病人提供更具個性化的治療[41]，達到“精準”治療腫瘤的目的[42]．

圖3 合成致死性原理Fig. 3 Principle of synthetic lethality

圖4 合成致死性方法在抗腫瘤藥物研究中可能的應用Fig. 4 Possible applications of synthetic lethality in anticancer drug development

基因組的不穩(wěn)定性和基因突變被公認為是腫瘤細胞的一大特征[43]．DNA損傷及由腫瘤細胞活躍的生長因子和原癌基因誘導的 DNA復制壓力造成了基因組的不穩(wěn)定．DNA損傷修復基因(DNA damage response，DDR)的突變或沉默在腫瘤細胞中很常見，所以 DDR基因也被認為是一類抑癌基因．在腫瘤中，一些 DDR基因的缺失導致其他 DNA修復元素代償性地上調(diào)，這樣就會對基于破壞 DNA的放化療(如 DNA烷化劑等)產(chǎn)生抵抗性，造成治療效果不佳或耐藥性[44-45]．因此，癌細胞為了生存而過度依賴的被上調(diào)的 DDR通路就可以被作為靶點進行抑制，以引發(fā)不可修復的 DNA損傷，達到誘導腫瘤細胞凋亡的目的．簡單地說就是 DDR修復的多重機制中潛在地存有多對合成致死搭檔[46-47]．一個最明顯應用合成致死的例子就是在癌細胞中的 BRCA1/2(breast cancer susceptibility gene，BRCA)參與DNA修復，其突變造成 DNA修復障礙，與其協(xié)同修復 DNA的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP)ribose polymerase，PARP)旁路則成為癌細胞更為倚重的修復途徑．在BRCA1/2突變的癌細胞對 PARP抑制劑的敏感度比非突變細胞大兩個數(shù)量級[48]．在 2016年被 FDA獲批上市的 PARP抑制劑 Rucaparib(AG 014699)正是利用了這一原理設計產(chǎn)生的，并且臨床試驗證實其對鉑類藥物敏感的高度惡化的漿液性卵巢癌、子宮內(nèi)膜上皮癌、原發(fā)性腹膜癌、輸卵管癌和有害生殖系統(tǒng)或體細胞BRCA1/2突變的三陰性乳腺癌等有明顯的活性[49-52]．有意思的是，盡管 PARP抑制劑最初被設計用來作為抗腫瘤藥物的增敏劑，但是有研究顯示某些PARP抑制劑(如Olaparib，已由FDA批準)作為單獨用藥在對癌細胞的抑制作用也非常突出[53]．研究發(fā)現(xiàn) FEN1和人體中諸多癌癥相關基因如 RAD54B、CDC4、MRE11A、RNF20和 SMC3構成合成致死搭檔．其中 RAD54B是一種在體細胞突變成癌細胞的過程中發(fā)生變異的基因，具有影響染色體穩(wěn)定性的作用[32]；CDC4是一種在多種腫瘤中突變的基因(如前列腺癌、胰腺癌和結直腸癌)；RNF20、SMC3和MRE11A 是在結腸直腸癌中高突變的基因[33]．研究表明，F(xiàn)EN1在細胞中可以與多種蛋白交互作用以控制形成信號網(wǎng)絡[54]，這就為合成致死策略提供了可能．事實上，F(xiàn)EN1被認為可能與DDR通路中的多個重要基因構成合成致死搭檔，這些基因的突變可在多種不同腫瘤中出現(xiàn)[55]．DNA修復機制與 FEN1抑制劑的作用如圖 5所示，其中：BRCA表示乳腺癌易感基因，F(xiàn)ANC表示范科尼貧血互補基因，ATM表示毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥突變基因，DNA-PK表示DNA依賴性蛋白激酶，XRCC表示X射線修復交叉互補蛋白．

圖5 DNA修復機制與FEN1抑制劑的作用Fig. 5 DNA repair mechanism and the roles of FEN1 inhibitors

為了修復內(nèi)源和外源 DNA損傷，細胞應用一系列DNA修復機制．總體上可以分為DNA單鏈(DNA single-strand break)和 DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand break)修復機制．其中 DNA 單鏈斷裂修復又包括堿基切除修復、核苷酸切除修復、錯配修復；DNA雙鏈斷裂修復包括同源重組和非同源末端連接．而能夠與FEN1抑制劑(藍色實線橢圓)構成潛在合成致死性搭配的其他 DNA修復系統(tǒng)(紅色點線橢圓)的缺失，經(jīng)常在癌細胞中出現(xiàn)．因此，F(xiàn)EN1的小分子抑制劑是潛在的新型抗癌藥物．

4 FEN1抑制劑的研究進展

近年來關于FEN1抑制劑的報道逐漸增多，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠在蛋白表達水平上下調(diào)FEN1的表達，這可能是姜黃素抑制乳腺癌細胞增殖的機制之一[56]；還發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過對 FEN1的下調(diào)增加乳腺癌細胞對順鉑的敏感性[57]．中藥鐵筷子中分離的一種強心苷類成分HTF-1能劑量依賴性地下調(diào)FEN1的表達，這也是此化合物能夠抑制癌細胞的原因之一[58]. FEN1酶活性抑制劑包括 NSC-281680[34]和NSC-13755[59]．NSC-281680能夠抑制 FEN1的核酸內(nèi)切酶活性，進而影響長補丁堿基切除修復．此化合物能夠增敏 DNA烷基化抗腫瘤藥物替莫唑胺對HCT-116人結腸癌細胞的細胞毒性，為聯(lián)合用藥提供了一種可能[34]．通過基于機器學習的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)一種名為JFD00950萘醌類化合物具有FEN1催化抑制活性[60]．事實上，研究最充分的是基于 N-羥基脲類化合物的抑制劑．這種抑制劑在 2005年被首次報道，在酶水平上其具有納摩爾級別的 IC50值，其可能的抑制 FEN1酶活的抑制機制為其能夠配位結合(coordination)FEN1發(fā)揮活性所必需的二價金屬鎂金屬離子，其可能的兩種模式如圖 6所示[35]．在2016年英國謝菲爾德大學的 Jane Grasby教授對這類抑制劑進行了系統(tǒng)的研究，得到了FEN1與化合物1的共結晶，這為研究 N-羥基脲類化合物的 FEN1抑制活性提供了非常重要的依據(jù)[61]．化合物 1(圖 7)能夠通過抑制 DNA底物的“去堿基配對化”抑制FEN1的活性，并且化合物 1能夠明顯增敏 SW620人結腸癌細胞對甲基磺酸甲酯(MMS)的敏感型．此后其他研究組也陸續(xù)報道N-羥基脲類化合物能抑制細胞增殖，激發(fā)染色體不穩(wěn)定性，并且能夠增敏某些DNA損傷型抗腫瘤藥物，這一結論在細胞和動物模型中得到證實[62]．

圖6 N-羥基脲類化合物的可能作用機制Fig. 6 Possible mechanism of N-hydroxyurea compounds

圖7 N-羥基脲類化合物中一種典型代表Fig. 7 A typical representative of N-hydroxyurea compounds

此外，近期報道[23,31,63]還顯示，N-羥基脲類化合物還能增敏化療藥物紫杉醇、逆轉細胞對順鉑的耐藥性以及對 PARP1和 PARP2缺失的細胞表現(xiàn)出高度藥物敏感性．

5 結 語

(1) FEN1是一個腫瘤抑制酶，其在維持基因組穩(wěn)定性方面具有重要作用，但是FEN1的過表達在多種腫瘤中出現(xiàn)，意味著其在腫瘤的快速增殖中扮演重要角色，可以潛在地作為多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預后的生物標志物．

(2) FEN1在細胞中蛋白表達水平或催化活性的動態(tài)調(diào)節(jié)過程值得關注．雖然已有一些FEN1抑制劑被發(fā)現(xiàn)，但是近年來關于新型的抑制劑報道很少，隨著FEN1晶體結構和作用機制的逐步揭示，關于其抑制劑的研究也是今后的一個研究方向．

(3) 隨著FEN1和其合成致死搭檔的逐步揭示，F(xiàn)EN1抑制劑有可能在治療基因特異型腫瘤中發(fā)揮作用．