錢 娜，王小兵，2*，汪曉麗，封 克，2，陳 盾，蘇金成，崔夢涵

（1.揚州大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.江蘇省有機固廢廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225127）

花生是我國重要的油料和經(jīng)濟作物，由于土壤利用的限制以及其經(jīng)濟效益相對較高，在花生主要種植區(qū)其連作現(xiàn)象十分普遍。然而，花生連作會產(chǎn)生連作障礙效應，即連作年限越長，產(chǎn)量和品質(zhì)下降越厲害，這嚴重影響了花生生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展[1-2]。自毒作用是花生連作障礙的重要原因之一[3]。自毒作用是指根系分泌和植株殘茬釋放的化感物質(zhì)對植物生長產(chǎn)生的抑制作用[4-5]。花生[6]、煙草[7]、黃瓜[8]等根系分泌的化感物質(zhì)對植株幼苗的株高、根長和根系活力都表現(xiàn)出抑制作用，并且抑制程度隨著化感物質(zhì)濃度增加而增強。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)花生根系分泌的化感物質(zhì)會影響根系微生物群落結(jié)構(gòu)，從而導致花生土傳病害的加重。王小兵等[10]通過根系分泌物循環(huán)收集系統(tǒng)結(jié)合GC-MS鑒定出花生根系分泌物中有苯甲酸、苯乙酮、丙三醇、3、5-二甲基苯甲醛、硬脂酸、棕櫚酸和乳酸等7種化感物質(zhì)。袁云云等[11]采用GC-MS鑒定出花生根系分泌物中含有鄰苯二甲酸、硬脂酸、油酸、十二酸、十四酸、十六酸等化感物質(zhì)。

1988年，Schmidt等[12]開展了土壤中胡桃醌的微生物降解試驗，提出微生物降解土壤中化感物質(zhì)的主要原理是微生物利用化感物質(zhì)作為碳源進行同化降解。Dong等[13]從人參幼苗根際土壤中分離到鄰苯二甲酸二異丁酯降解菌鞘氨醇桿菌PG-1，該菌在72 h內(nèi)降解了90%以上的鄰苯二甲酸二異丁酯。Liu等[14]從尾葉桉根中分離出3株柔膜菌（Helotialessp.）Eu03、Eu04和Eu05，其中Eu04菌株能夠顯著降解苯甲酸、對羥基苯甲酸和香草酸3種混合酚酸。Chen等[15]從黃瓜根際土壤中篩選一株對羥基苯甲酸降解菌CSYP1，該菌應用于對羥基苯甲酸污染的黃瓜種植土后，土壤中某些酶活性增加，對羥基苯甲酸濃度降低。目前，針對花生化感物質(zhì)降解菌的研究較少[16-17]。苯甲酸及其衍生物是一類比較重要的化感物質(zhì)，在多種植物根系分泌物中均有檢測到[18]，而且前期研究發(fā)現(xiàn)苯甲酸對花生發(fā)芽以及幼苗生長有顯著抑制作用。本研究擬從連作花生試驗地健康植株根際土壤中篩選苯甲酸降解菌，并研究其降解特性，為利用降解菌緩解花生連作障礙提供資源保障和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

從中國科學院紅壤生態(tài)實驗站花生連作長期定位試驗地，于花生開花期挖取5棵健康植株，去除根部大顆粒土塊，采用抖動法采集根際土壤，分別裝袋后帶回實驗室，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（LB）:牛肉浸膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，加去離子水定容至1 L，pH 7.2～7.4。

無機鹽培養(yǎng)基（MS）:KH2PO43 g，Na2HPO45 g，NaCl 0.001 g，CaCl2·H2O 0.003 g，MgSO4·5H2O 0.003 g，加去離子水定容至1 L，pH 7.0。

選擇培養(yǎng)基:在無機鹽培養(yǎng)基上按濃度要求加入0.22μm微孔濾膜過濾的苯甲酸母液（10 g·L-1）。

以上固體培養(yǎng)基需加入2%瓊脂，經(jīng)121℃、20 min高壓滅菌備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解菌的篩選

降解菌的篩選采用以苯甲酸為唯一碳源，逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法[19]。具體操作如下:準確稱取10 g土樣，加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，恒溫搖床中充分振蕩30 min，制成1∶10濃度的土壤懸濁液。待土粒沉淀后，吸取1 mL上清液，移入裝有9 mL無菌水的試管中，制成10-2菌懸液，以此類推，制成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液。選擇 10-4、10-5、10-6、10-7四個濃度各100μL，加入到苯甲酸選擇培養(yǎng)基中，苯甲酸濃度按5、10、15、20 mg·L-1依次提高梯度馴化與富集降解菌。經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，梯度稀釋培養(yǎng)液并涂布于20 mg·L-1苯甲酸固體選擇培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取菌落形態(tài)不同的單菌落接種至LB固體培養(yǎng)基上，反復劃線分離純化得到純菌株，菌株經(jīng)試管斜面富集培養(yǎng)后保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 降解菌的鑒定

1.2.2.1 降解菌形態(tài)特征鑒定

降解菌經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，觀察其菌落形狀、大小、顏色、透明度、黏稠度、濕潤度、隆起和邊緣特征及是否產(chǎn)色素等，菌體染色后用高倍顯微鏡觀察菌體革蘭氏染色、鞭毛、莢膜、芽孢等結(jié)構(gòu)。菌液經(jīng)戊二醛固定乙醇脫水和冷凍干燥后，掃描電鏡觀察菌體大小和表面結(jié)構(gòu)。

1.2.2.2 降解菌生理生化特性測定

1.2.2.3 降解菌16S rDNA基因序列的測定及分子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

降解菌基因組DNA采用試劑盒（快速提取盒）提取菌株的總DNA[21]，用16S rDNA通用引物27 F（正向引物）[22]:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492 R（反向引物）:5′-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-3′，以分離降解菌的總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系（50μL）:DNA模板1μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，Tap 酶（5 U·μL-1）0.5 μL，雙蒸水 37.5μL。擴增程序:95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72℃ 75 s；32次循環(huán)，72 ℃ 10 min；反應完成后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳，檢測擴增片段的大小和特異性。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測純化，送上海生工進行雙向測序并拼接輸出全序列，16S rDNA序列與Genebank中已收錄的16S rDNA序列進行同源性比對，采用ClustalX 1.8進行序列匹配分析，通過MEGA 6.0軟件使用鄰接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap（1000次重復）檢驗各分支的置信度。

1.2.3 環(huán)境因子對降解菌降解特性的影響

1.2.3.1 培養(yǎng)初始pH

降解菌按0.1%（OD600nm=0.8）接種量接種到含20 mg·L-1苯甲酸的無機鹽培養(yǎng)液中，pH分別為4、5、6、7、8、9、10，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后測定菌體生長量和苯甲酸的降解率，菌體生長量是以不接種降解菌的培養(yǎng)基作對照，每處理3次重復。測定處理后600 nm處的吸光度值，苯甲酸的降解率為處理前后苯甲酸濃度差與起始苯甲酸濃度的百分比。

1.2.3.2 培養(yǎng)溫度

降解菌按0.1%（OD600nm=0.8）接種量接種到pH 7.0、含20 mg·L-1苯甲酸的無機鹽培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為25、30、35、40、45 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后測定菌體生長量和苯甲酸的降解率，菌體生長量是以不接種降解菌的培養(yǎng)基作對照，每處理3次重復。

1.2.3.3 NaCl濃度

降解菌按0.1%（OD600nm=0.8）接種量接種到pH 7.0、含20 mg·L-1苯甲酸的無機鹽培養(yǎng)基中，控制NaCl濃度為0、2、4、6、8、10 mg·kg-1，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，48 h后測定菌體生長量和苯甲酸的降解率，菌體生長量是以不接種降解菌的培養(yǎng)基作對照，每處理3次重復。

日常的教學是長期、系統(tǒng)的過程。瑜伽課程是本校新開發(fā)的校本課程，筆者進行了一些思考，為了避免重蹈覆轍，教學內(nèi)容上不再僅僅局限于瑜伽的各個單獨體式的學習，而是豐富了教學的內(nèi)容和形式。在理論部分，除了介紹瑜伽的起源與發(fā)展外，增加了瑜伽的流派、飲食等內(nèi)容，讓學生更好更全面的了解瑜伽文化。在實踐部分，加強了雙人瑜伽學習，再結(jié)合學生喜愛的流行音樂，將瑜伽體式融入其中?？傊?，唯有做到教學內(nèi)容的多元化，形式多樣化，才能使這門課程具有長期的吸引力和活力。

1.2.4 化感物質(zhì)的提取與分析

用1∶1的乙醇乙醚混合萃取液萃取苯甲酸、苯乙酮、硬脂酸、棕櫚酸、乳酸、3，5-二甲基苯甲醛和丙三醇處理前后培養(yǎng)液3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，甲酯化，冷卻后用正己烷萃取，用氣相色譜儀檢測其降解率。氣相色譜法（GC）測定條件:GC分析在Agilent氣相色譜儀上進行，采用FID檢測器；柱子型號HPFFAP，規(guī)格 30 m×0.32 mm×0.25μm，不分流，載氣N2（99%），流量14.0 mL·min-1，柱溫220℃，程序升溫10℃·min-1，并在220℃時保持10 min，進樣口溫度260℃，檢測器溫度260℃，進樣量1μL。每處理3次重復。

1.2.5 底物專一性

降解菌按0.1%（OD600nm=0.8）接種量接種到以苯乙酮、硬脂酸、棕櫚酸、乳酸、3，5-二甲基苯甲醛和丙三醇等化感物質(zhì)為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中（20 mg·L-1），30 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后測定菌體生長量和化感物質(zhì)降解率，菌體生長量是以不接種降解菌的培養(yǎng)基作對照，每處理3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016作圖；SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析，One way ANOVA進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生化感物質(zhì)降解菌的篩選

降解菌初篩結(jié)果見表1，以苯甲酸為唯一碳源，按5、10、15、20 mg·L-1濃度依次提高梯度馴化與富集共篩選出6株降解菌。其中降解菌HJ-2和HJ-3生物量最大，OD值分別達到0.88和0.76，對苯甲酸的降解率達到96.88%和92.65%。

2.2 花生化感物質(zhì)降解菌的鑒定

2.2.1 菌體形態(tài)及生理生化特征

降解菌HJ-2在LB培養(yǎng)基上呈黃色，凸起，外緣圓整，半透明，表面濕潤，革蘭氏陰性，短桿狀，大小為（0.7～1.6）μm×（1.0～1.5）μm（圖1A）。降解菌HJ-3在LB培養(yǎng)基上呈白色，半透明，邊緣不規(guī)則，表面光滑，革蘭氏陰性，桿狀，大小為（0.5～1.0）μm×（1.5～4.0）μm（圖1B）。降解菌HJ-2能與葡萄糖反應產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能水解淀粉，液化明膠，接觸酶陽性，好氧。降解菌HJ-3接觸酶試驗、氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、檸檬酸鹽試驗均為陽性（表2）。

表1 不同菌株對苯甲酸的降解率Table 1 Degradation rate of benzoic acid by different strains

2.2.2 16S rDNA基因測序與分析

圖1 降解菌HJ-2和HJ-3的透射電鏡圖Figure 1 Transmission electron microscopy（TEM）images of strain HJ-2 and stain HJ-3

對降解菌進行基因組DNA的提取，并完成16S rDNA基因測序，將得到的序列與GenBank中已知序列進行比對，并對兩種未知的降解菌HJ-2和HJ-3分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。16S rDNA序列同源性比對表明，降解菌HJ-2與木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）同源性最近，序列相似性高達100%；HJ-3則與硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens）同源性最近，序列相似性達99%。結(jié)合細菌的主要形態(tài)特征和生理生化特征，將降解菌HJ-2和HJ-3所測序列結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號分別為MH324393和MH324395。

2.3 不同環(huán)境因素對降解菌生長的影響

為了研究不同環(huán)境條件下降解菌HJ-2和HJ-3對苯甲酸的降解情況，選擇初始pH、溫度、NaCl濃度3個影響因素作為研究對象，進行單因素實驗。實驗結(jié)果如圖3所示，pH對2株降解菌均有影響，降解菌HJ-2最適宜的pH在6.0～9.0之間，而降解菌HJ-3最適宜的pH在6.0～8.0之間，pH過高或過低都會對兩株菌產(chǎn)生抑制（圖3A）。由圖3B可知，降解菌HJ-2適宜生長溫度范圍較廣，在30～45℃下生長良好；降解菌HJ-3適宜生長溫度為30～35℃，不耐受高溫。降解菌HJ-3對NaCl濃度的變化較為敏感（圖3C），當NaCl濃度大于4%時，其生長受到抑制，最適宜生長NaCl濃度為0～4%；降解菌HJ-2耐受NaCl能力較強，適宜NaCl濃度為0～6%?？傊到饩鶫J-2對逆境的耐受能力較降解菌HJ-3強。

表2 降解菌HJ-2和HJ-3的形態(tài)和生理生化特征Table 2 Morphological features and biochemical，physiological of degrading bacteria HJ-2 and HJ-3

圖2 基于降解菌HJ-2和降解菌HJ-3基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Neighbour-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strains HJ-2 and HJ-3

2.4 降解菌對其他化感物質(zhì)的降解性能

為了研究篩選的降解菌對其他化感物質(zhì)是否有降解作用，利用前期鑒定的苯乙酮、硬脂酸、3，5-二甲基苯甲醛、棕櫚酸和乳酸和丙三醇等6種花生化感物質(zhì)進行降解試驗，結(jié)果見表3。在以化感物質(zhì)為唯一碳源的無機鹽中，降解菌HJ-2除了在丙三醇中生長較差以外，其他5種化感物質(zhì)均能有效降解；降解菌HJ-3在以3，5-二甲基苯甲醛、硬脂酸、棕櫚酸和苯乙酮為唯一碳源中的生長較好，而在乳酸和丙三醇中生長最弱。由此可見這兩株降解菌均可以利用其他化感物質(zhì)為碳源生長，具有廣譜的降解功能。

3 討論

李曉芝等[23]認為采用生物降解技術(shù)是克服植株自毒作用的一種有效措施，其優(yōu)點在于對作物生長沒有影響的情況下進行修復，而且沒有二次污染，是一種高效環(huán)保的生物修復方法，而篩選和分離化感物質(zhì)高效降解菌是該項技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究通過富集培養(yǎng)的方法篩選到兩株高效化感物質(zhì)降解菌HJ-2和HJ-3，經(jīng)鑒定為木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）和硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens）。

表3 兩株降解菌對不同化感物質(zhì)的降解性能Table 3 Degradation rate of strain HJ-2 and strain HJ-3

圖3 不同pH、溫度和NaCl濃度對降解菌HJ-2和HJ-3生長的影響Figure 3 Biomass of strain HJ-2 and strain HJ-3 in the condition of different pH，temperature and salinity

微生物對烯烴類有機物最容易降解，其次是烷烴類有機物，而對芳烴類物質(zhì)較難降解，特別是多環(huán)芳烴以及脂環(huán)芳烴最難降解。木糖氧化無色桿菌和硝基還原假單胞菌對較難降解的有機物質(zhì)均有顯著降解作用，前期研究表明木糖氧化無色桿菌對直烷烴類[24]和苯甲酰脲類[25]降解率達90%，對具有苯環(huán)類有機物如四環(huán)素類抗生素降解率為60%左右[26]，另外該菌對多環(huán)芳烴[27]和芘[28]也有顯著降解作用；硝基還原假單胞菌對三唑類[29]和氯苯類化合物等[30]降解率達90%，對雙酚A[31]和鄰苯二酚[32]等酚類有機物也有顯著降解效果，降解率分別達80%和95%。前期關(guān)于這兩類菌株在化感物質(zhì)降解方面的研究較少[33]，本研究發(fā)現(xiàn)木糖氧化無色桿菌HJ-2和硝基還原假單胞菌HJ-3能夠顯著降解苯甲酸、苯乙酮和3，5-二甲基苯甲醛等帶有苯環(huán)類以及硬脂酸、棕櫚酸等長鏈飽和脂肪酸的化感物質(zhì)，豐富了化感物質(zhì)降解菌的種類，為緩解植物自毒作用提供了可靠資源保障。

降解效率的高低是降解菌能否應用的前提條件。祁國振等[34]從蘋果根際篩選了多株自毒物質(zhì)降解菌，降解效率最好的降解菌BL2對鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、根皮苷、焦性沒食子酸的降解率分別為66%、72%、84%和84%。何志剛等[17]分離的3株苯甲酸降解菌對苯甲酸的降解率只有95.32%、91.63%和90.15%。而本研究分離的降解菌HJ-2和HJ-3對苯甲酸的降解率分別達到96.88%和92.65%，其中降解菌HJ-2與已研究的降解菌相比具有較高的降解效率。

降解菌必須有較強的環(huán)境適應能力才有實際應用意義。本研究分析了兩株降解菌對pH、溫度以及NaCl濃度等環(huán)境因子的適應情況。pH對細胞酶活性有較大影響，強酸或強堿都會引起蛋白變性、破壞細胞膜。趙東岳等[35]篩選到的5株人參自毒物質(zhì)降解菌在pH 6.0～7.0時生長狀態(tài)最好，而本研究中降解菌HJ-2適宜pH為6.0～9.0，降解菌HJ-3適應pH為6.0～8.0，兩株降解菌均有較好的pH耐受范圍，而且降解菌HJ-2對pH耐受范圍更寬；溫度過高或過低均會抑制細胞酶活性，進而影響微生物的生長，也會導致化感物質(zhì)降解菌降解效率的降低。黃興如等[36]篩選的幾株可降解多環(huán)芳烴降解菌適宜溫度均低于40℃，本研究中降解菌HJ-2適宜溫度為30～45℃，具有較寬的溫度范圍；微生物生長環(huán)境中NaCl濃度太高會使微生物在細胞外界滲透壓過高，造成細胞缺水死亡，另外過量的鈉離子會抑制細胞酶的活性，因此微生物都有一定的NaCl濃度范圍，降解菌HJ-2在NaCl濃度升高到6%后降解率顯著下降，而降解菌HJ-3在NaCl濃度升高到4%以后降解率顯著下降，這可能與細胞受到NaCl的抑制有關(guān)。朱星等[27]篩選了一株降解萘的無色桿菌，能夠耐受1%～2%NaCl濃度，本研究中降解菌HJ-2也是無色桿菌屬，而該菌能夠耐受更高的NaCl濃度，具有更好的環(huán)境適應能力。

花生根系分泌多種化感物質(zhì)，環(huán)境中化感物質(zhì)均以混合形式存在，篩選的降解菌能否對其他化感物質(zhì)有降解作用更具有實際應用意義。有研究表明，里拉微球菌、紫金牛葉桿菌和理氏勒米諾氏菌降解油酸、十六烷酸、鄰苯二甲酸等為花生主要化感物質(zhì)[16]。何志剛等[17]分離的3株苯甲酸降解菌能夠降解多種醛酸類物質(zhì)。本研究篩選的兩株降解菌均能降解多種花生化感物質(zhì)，特別是降解菌HJ-2降解能力更強，表明該菌是一株用于防治花生自毒作用的理想菌株。

4 結(jié)論

（1）從連作花生長期定位試驗基地健康花生根際土壤中分離到兩株高效化感物質(zhì)降解菌HJ-2和HJ-3，通過鑒定分別為木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidansHJ-2）和硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducensHJ-3）。

（2）通過單因素試驗對降解菌進行降解特性測定，降解菌HJ-2的適宜降解條件為pH 6.0～9.0，溫度30～45℃，NaCl濃度0～6%；降解菌HJ-3適宜降解條件為pH 6.0～8.0，溫度30～35 ℃，NaCl濃度0～4%。

（3）兩株降解菌能夠降解多種化感物質(zhì)，具有廣譜降解化感物質(zhì)的特性。