周顯勇，劉鴻雁*，劉艷萍，劉青棟，涂 宇，顧小鳳，吳龍華

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025；3.中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008）

隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)?；沫h(huán)素類、磺胺類及喹諾酮類等抗生素作為治療劑或生長促進(jìn)劑被廣泛使用[1-2]?？股卦趧游矬w內(nèi)不能被完全吸收，85%以上以原形或代謝物形式隨畜禽排泄物排出[3]，其在環(huán)境中富集將會誘導(dǎo)耐藥菌株產(chǎn)生，對環(huán)境微生態(tài)造成嚴(yán)重影響[4]。同時，在畜禽飼料和排泄物中還檢測出Zn、Cu、As和Cd等重金屬[5]。貴陽市某蔬菜基地長期利用養(yǎng)豬場養(yǎng)殖廢水灌溉，導(dǎo)致土壤抗生素和重金屬復(fù)合污染，其中Cd已達(dá)到中度污染水平[6]。選擇合理有效的修復(fù)措施來降低重金屬和抗生素復(fù)合污染的危害，是養(yǎng)殖廢水灌溉區(qū)亟待解決的問題。

抗生素在環(huán)境中的降解方式主要有水解、光解和生物降解等[7]，在土壤中以生物降解為主，光解可發(fā)生在土壤表層，水解僅發(fā)生在土壤間隙水等水體中[8]。生物降解主要分為植物降解和微生物降解。有研究發(fā)現(xiàn)，水生植物大漂、鳳眼蓮對水體中鹽酸四環(huán)素和氨芐青霉素去除率在70%以上[9]；黑麥草對四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類等抗生素的去除率為3.4%～28.8%[10]。伴礦景天（Sedum plumbizincicola）是一種對Zn、Cd有超富集能力的植物，在污染土壤修復(fù)中被廣泛使用。有研究表明，使用3種植物對Cd、Cu和多氯聯(lián)苯復(fù)合污染土壤修復(fù)時，修復(fù)效率表現(xiàn)為伴礦景天＞海州香薷＞紫花苜蓿[11]；伴礦景天對重金屬的修復(fù)效率較高，在多次修復(fù)后，土壤中Cd和Zn分別下降了50.0%和5.8%[12]；經(jīng)伴礦景天修復(fù)后土壤有效態(tài)Cd、Zn和Pb呈降低趨勢[13]。本試驗(yàn)選用伴礦景天對抗生素和重金屬復(fù)合污染土壤進(jìn)行修復(fù)，以常規(guī)種植芹菜為對照，研究超富集植物修復(fù)和常規(guī)蔬菜種植條件下，土壤重金屬的去除率以及抗生素的降解率，利用土壤微生物數(shù)量和酶活性來表征土壤生物活性的變化，探索土壤微生物、酶與重金屬和抗生素之間相互作用的關(guān)系，進(jìn)一步明晰植物修復(fù)下土壤微環(huán)境的變化，為抗生素和重金屬復(fù)合污染土壤修復(fù)治理和安全利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

試驗(yàn)地點(diǎn)位于貴陽市烏當(dāng)區(qū)某蔬菜種植基地（106°47′49″E，26°37′49″N），該基地長期使用畜禽養(yǎng)殖場養(yǎng)殖廢水進(jìn)行灌溉，菜地土壤為黃壤，pH為6.85，有機(jī)質(zhì)為（65.94±3.37）g·kg-1。土壤中重金屬Zn、Cd、Pb、As、Cr含量分別為（139.81±7.87）、（0.56±0.04）、（52.45±2.89）、（13.94±1.30）、（42.07±2.01）mg·kg-1；四環(huán)素類抗生素中四環(huán)素Tetracycline（TTC）、土霉素 Oxytetracycline（OTC）、強(qiáng)力霉素 Doxycycline（DOC）含量分別為（2.57±0.14）、（3.08±0.24）、（2.33±0.12）μg·kg-1；磺胺類抗生素中磺胺二甲嘧啶Sulfamethazine（SMX）、磺 胺 甲 惡 唑 Sulfamethoxazole（SMZ）、磺胺間甲氧嘧啶Sulfamonomethoxine（SMM）、磺胺對甲氧嘧啶Sulfametoxydiazin（SMD）含量分別為（0.60±0.06）、（1.54±0.14）、（3.88±0.40）、（2.00±0.18）μg·kg-1；喹諾酮類抗生素中諾氟沙星Norfloxacin（NFC）、氧氟沙星Ofloxacin（OFC）、環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin（CFC）、恩諾沙星Enrofloxacin（EFC）含量分別為（10.92±0.57）、（12.74±0.94）、（7.02±0.50）、（5.42±0.45）μg·kg-1。土壤重金屬和抗生素明顯累積[6]，其中Cd含量為0.32～0.75 mg·kg-1，屬于中度污染水平。

1.1.2 供試植物

重金屬修復(fù)植物伴礦景天（Sedum plumbizincicola）由中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；芹菜（Apium graveolensL.）為當(dāng)?shù)胤N植的津南實(shí)芹。

1.2 試驗(yàn)與分析方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計

本試驗(yàn)為田間試驗(yàn)，設(shè)置2個處理，處理1:常規(guī)芹菜種植（Cel）；處理2:伴礦景天修復(fù)（Sed）。每處理3次重復(fù)，共6個試驗(yàn)小區(qū)，各小區(qū)（1.5 m×6.0 m）隨機(jī)排列，每小區(qū)種植3行，每行30株，共90株，種植密度為10株·m-2，每兩個小區(qū)間設(shè)置0.2 m保護(hù)行。

1.2.2 樣品采集與處理

試驗(yàn)時間:2014年10月至2015年7月。

植物樣品:伴礦景天在2014年10月育苗，11月進(jìn)行移栽；芹菜在2015年3月育苗移栽。植物樣統(tǒng)一在2015年5月15日收獲，采集植物地上部，芹菜和伴礦景天稱取鮮質(zhì)量后分別用自來水、去離子水洗滌，105℃殺青30 min，80℃烘干、稱量、粉碎、備用。

土壤樣品:采用梅花布點(diǎn)法分別采集各小區(qū)土壤耕作層（0～20 cm）鮮樣，混合均勻，裝入密封袋中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分置于4℃冰箱中保存，用于微生物和酶活性的檢測；一部分進(jìn)行真空冷凍干燥48～72 h，將凍干后的樣品研碎過60目篩，置于-20℃冰箱中保存，用于抗生素含量分析；另一部分在室內(nèi)風(fēng)干后粉碎過篩，用于土壤理化性質(zhì)和重金屬濃度分析。

1.2.3 測定項(xiàng)目及方法

土壤抗生素用超聲波提取，固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法，內(nèi)標(biāo)物為13C-咖啡因[14]；細(xì)菌和真菌數(shù)量測定采用稀釋平板計數(shù)法[15]；過氧化氫酶采用滴定法[16]；脲酶采用苯酚-次氯酸鈉比色法[17]；土壤磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸氫二鈉基質(zhì)，比色法測定[18-19]；土壤重金屬全量用HF-HNO3-HClO4消解[20]，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，Thermo Fisher Scientific X2）測定；形態(tài)分析用BCR連續(xù)提取法[21]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS和SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Origin 8.5進(jìn)行繪圖。處理間大部分指標(biāo)未達(dá)到極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物地上部重金屬含量

檢測結(jié)果（表1）顯示，芹菜地上部Zn、Cd、Pb、As和Cr平均含量分別為46.85、0.16、0.09、0.44 mg·kg-1和0.38 mg·kg-1，均未超過國家食品安全限量值（GB 2762—2017）。長期污灌條件下，土壤pH顯著升高[6]，平均值為6.85，土壤重金屬活性較低，在污染土壤上種植芹菜是安全的。伴礦景天地上部Zn、Cd、Pb、As和Cr的平均含量分別為618.70、4.25、0.75、0.55 mg·kg-1和0.24 mg·kg-1，重金屬Zn和Cd顯著富集，收獲的伴礦景天植株風(fēng)干后與城市生活垃圾一起做填埋處理。

2.2 土壤重金屬含量變化及形態(tài)分布特征

種植植物前土壤Zn、Cd、Pb、As和Cr平均含量分別為 139.81、0.56、52.45、13.94 mg·kg-1和 42.07 mg·kg-1（圖1）。伴礦景天修復(fù)處理土壤后重金屬Zn、Cd和Pb顯著降低，為121.35、0.46 mg·kg-1和46.02 mg·kg-1，超富集植物對重金屬富集具有專一性，伴礦景天對Zn和Cd有超富集作用，因此土壤Zn和Cd顯著降低，As、Cr沒有變化。種植芹菜處理土壤重金屬也有所減少，但除Cr外，均未達(dá)到顯著差異水平。

如圖2所示，伴礦景天修復(fù)下，土壤中Zn和Cd的殘?jiān)鼞B(tài)變化一致，都呈現(xiàn)顯著下降趨勢；Zn的可氧化態(tài)和可還原態(tài)顯著下降，但可交換態(tài)顯著增加，可能與根系分泌物的酸溶作用有一定關(guān)系；Cd的可氧化態(tài)和可還原態(tài)沒有顯著變化，可交換態(tài)顯著降低，同時可交換態(tài)As也顯著下降，可見，種植伴礦景天可降低Cd和As的生物有效性，減輕其對土壤微生物和酶活性的毒害作用，這一結(jié)果與程晨[22]的研究結(jié)果相似。在種植芹菜后，土壤Cd和As的可交換態(tài)分別下降93.1%和27.1%，也達(dá)到了降低重金屬生物有效性、提高土壤生物活性的效果。

圖1 土壤重金屬含量變化Figure 1 Change of the content of heavy metals in soil

表1 植物地上部重金屬含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，mg·kg-1）Table 1 Heavy metal contents of plant（M±SD，mg·kg-1）

圖2 土壤中重金屬形態(tài)分布圖Figure 2 Fraction distribution of heavy metals in soil

2.3 植物修復(fù)下土壤中抗生素含量變化

試驗(yàn)土壤檢測出11種抗生素，分別為四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類。

如圖3所示，與種植作物前相比，植物修復(fù)后，土壤中四環(huán)素類抗生素都顯著下降（P＜0.05），種植伴礦景天后TTC、OTC、DOC分別下降了70.5%、57.4%、76.0%，種植芹菜后分別下降了46.1%、64.3%、46.8%。種植伴礦景天對三類抗生素的修復(fù)效果表現(xiàn)為DOC＞TTC＞OTC，這與抗生素的溶解度有一定關(guān)系。三類抗生素都可溶于水，溶解度為DOC＞TTC＞OTC，且三類抗生素的分子質(zhì)量均小于500。有研究表明，一般分子量小于500的抗生素能被植物直接吸收[23]，進(jìn)入植物的有機(jī)污染物，由植物內(nèi)部的代謝或者產(chǎn)生的酶分解為更簡單、毒性更小的物質(zhì)[24]；在脅迫環(huán)境下，植物根系不僅會分泌增加根際微生物代謝所需的物質(zhì)，也會分泌出與污染物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，以誘導(dǎo)根際微生物對污染物的降解[25]?？梢娫诜N植條件下，植物和土壤微生物對抗生素有強(qiáng)烈的生物降解作用；同時，表層土壤也有一定的光解作用，導(dǎo)致土壤抗生素含量顯著降低。

由圖4得出，在種植伴礦景天后，除了SMX沒有顯著變化外，SMZ，SMM和SMD均顯著降低（P＜0.05），分別下降了62.3%、54.2%和48.6%；而種植芹菜后，SMX和SMM分別較CK增加了2.8倍和1.2倍。如圖5所示，在種植伴礦景天后，喹諾酮類抗生素OFC和EFC顯著降低（P＜0.05），分別下降了35.8%和46.6%；種植芹菜后NFC顯著增加（P＜0.05）為CK的5.2倍?？赡苁前榈V景天吸收了土壤中的重金屬和抗生素，使土壤中的細(xì)菌和真菌數(shù)量增加，酶活性增大；微生物和土壤酶作為環(huán)境中的分解者和轉(zhuǎn)運(yùn)者，可分解抗生素；抗生素濃度的降低也可能與其自身分解（如水解和光解）有關(guān)。

圖4 土壤中磺胺類抗生素含量Figure 4 Content of sulfonamides in the soil

圖5 土壤中喹諾酮類抗生素含量Figure 5 Content of quinolones in the soil

在種植植物后，土壤中磺胺類的SMX、SMM和喹諾酮類的NFC、CFC的含量比CK高。有研究表明磺胺類和喹諾酮類抗生素是雙性化合物，當(dāng)pH＞pKa時，這兩類抗生素以陰離子形式存在于土壤溶液中；當(dāng)pH＜pKa時，以陽離子形式存在于土壤溶液中；當(dāng)pH接近pKa時，以兼性離子形式存在[26]；SMX、SMM、NFC和CFC的酸性解離常數(shù)分別為5.81、6.31、6.18和6.11，本試驗(yàn)地pH平均值為6.85，種植植物后，由于受到環(huán)境脅迫其根部會分泌出大量有機(jī)酸，使pH接近各抗生素的pKa，這4種抗生素以兼性離子形式存在于土壤溶液中，其陽離子被表面帶負(fù)電荷的土壤吸附而不容易遷移。有研究表明，有機(jī)污染物與土壤有機(jī)膠體表面的物質(zhì)反應(yīng)結(jié)合會形成具有母體特性的新物質(zhì)，此類物種相對穩(wěn)定不易遷移[27]。未種植植物時這兩類抗生素容易發(fā)生淋溶。有研究表明，植物覆蓋能有效降低土壤的淋溶[23]。以上兩類抗生素也容易被光解，種植植物后遮擋土壤，影響其光解速率。

2.4 植物修復(fù)下土壤微生物數(shù)量及酶活性變化

由表2可知，與CK相比在種植植物后，土壤中細(xì)菌、真菌的數(shù)量和脲酶、過氧化氫酶、磷酸酶等活性都增加，其中伴礦景天修復(fù)后增加顯著（P＜0.05），分別是CK組的1.2、1.7、1.2、1.6倍和1.2倍。

修復(fù)前土壤抗生素和重金屬復(fù)合污染，可能會抑制土壤中的微生物生長，降低細(xì)菌、真菌的數(shù)量，其中Cd達(dá)到中等污染水平，對土壤微生物活性有明顯的抑制作用[28]。植物修復(fù)后土壤微生物數(shù)量都呈增加趨勢，其中種植伴礦景天后增長達(dá)顯著水平（P＜0.05），這與能鳳嬌等[12]的結(jié)果相似。土壤微生物數(shù)量和酶活性變化幅度較大，除與污染物有關(guān)外，可能也與樣品采集時間有一定關(guān)系，修復(fù)后5月份土壤的溫度和水分都較修復(fù)前的10月份高。

表2 土壤微生物數(shù)量及酶活性變化Table 2 Change of the quantity of microorganism and enzyme activity in soil

抗生素能干擾微生物細(xì)胞新陳代謝的某個或幾個環(huán)節(jié)，從而抑制微生物的生長發(fā)育，重金屬進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，與必需營養(yǎng)元素或金屬競爭結(jié)合位點(diǎn)，致使微生物受到毒害。種植植物以后，植物根系感知外部污染物的刺激，把信號傳輸?shù)郊?xì)胞中，觸發(fā)預(yù)防機(jī)制，根部會選擇性地分泌代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物刺激相應(yīng)的微生物，形成一個植物根-微生物體系，該體系會將污染物質(zhì)降解或吸附[29]，且這些分泌物中含的氨基酸可為微生物提供C、N源，促進(jìn)了微生物數(shù)量的增加。

土壤脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶都對土壤重金屬污染比較敏感，是土壤重金屬污染的指標(biāo)。植物修復(fù)后，土壤脲酶、過氧化氫酶、磷酸酶等酶活性提高，尤其在伴礦景天修復(fù)后顯著提高（P＜0.05），這可能是伴礦景天的根系比較發(fā)達(dá)，有研究表明這3種土壤酶受植物根部微環(huán)境的影響較大[30]。目前國內(nèi)外主流的兩種抑制土壤酶活性的機(jī)理:一是污染物加入土壤后與酶分子中的活性部位結(jié)合，致使酶失活；二是土壤環(huán)境受到破壞，抑制了土壤微生物的生長和繁殖，減少微生物體內(nèi)酶的合成和分泌，最后導(dǎo)致土壤酶活性下降[31]。土壤污染物含量下降，減少與土壤酶活性部位的結(jié)合，且微生物數(shù)量增加，分泌出的酶也隨著增加。有研究表明，用黑麥草對抗生素污染土壤修復(fù)試驗(yàn)中，種植黑麥草土壤中微生物的呼吸強(qiáng)度和氨化強(qiáng)度分別是未種植黑麥草土壤的4.5倍和1.9倍[10]?？梢姡N植植物下，土壤中各種生化反應(yīng)強(qiáng)烈，酶活性增強(qiáng)。

2.5 土壤重金屬、抗生素與微生物及酶活性的交互作用

對土壤重金屬、抗生素、酶活性、微生物數(shù)量進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果見圖6。第一主成分方差貢獻(xiàn)率為61.58%，第二主成分為21.94%，累積方差貢獻(xiàn)率為83.52%。進(jìn)一步對前兩個主成分進(jìn)行分析，第一主成分的特征指標(biāo)有重金屬Zn、Cd、Pb和As，四環(huán)素類的3種抗生素，磺胺類的SMZ、SMM和SMD，喹諾酮類的OFC、CFC和EFC，細(xì)菌、脲酶和磷酸酶；除抗生素CFC，重金屬與其他抗生素均呈正相關(guān)，磺胺類抗生素與重金屬絡(luò)合后，改變了分子軌道能隙，影響降解速率，喹諾酮類抗生素與重金屬絡(luò)合后，會抑制其光降解[32-33]。細(xì)菌、脲酶和磷酸酶與除CFC以外的抗生素和重金屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，抗生素分子中含有的大量基團(tuán)或電子供體原子均可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，且絡(luò)合物在復(fù)合污染體系的毒理效應(yīng)中起主導(dǎo)作用。有研究表明，與單一污染相比，多數(shù)抗生素與重金屬復(fù)合污染對土壤微生物數(shù)量和種群多樣性等產(chǎn)生更為明顯的抑制[34]，微生物數(shù)量減少，酶的合成場所被破壞。

第二主成分的特征指標(biāo)是Cr、SMX、NFC、真菌和過氧化氫酶，Cr、NFC、SMX、過氧化氫酶、真菌間的變化趨勢與第一主成分指標(biāo)有較大差異。抗生素SMX和NFC對真菌有刺激作用，在一定范圍內(nèi)可以促進(jìn)真菌數(shù)量的增加，真菌與過氧化氫酶呈正相關(guān)。微生物為了減弱土霉素對自身的毒害作用，需要通過氧化代謝作用將其分解，而為了避免氧化劑過氧化氫的危害，會產(chǎn)生過氧化氫酶以分解殘留于體內(nèi)的過氧化氫[35]。

圖6 土壤重金屬、抗生素、微生物及酶主成分分析圖Figure 6 Soil heavy metals,antibiotics,microorganisms and enzyme principal components analysis

在重金屬和抗生素的復(fù)合污染土壤中，微生物數(shù)量和酶活性都會受到不同程度的抑制。在重金屬和抗生素的脅迫下，伴礦景天會分泌有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)，同時也吸收一部分重金屬和抗生素，在C、N源增加和污染物質(zhì)減少的環(huán)境中，微生物數(shù)量增加，酶活性也相應(yīng)提高。土壤微生物數(shù)量和酶活性的增加能進(jìn)一步促進(jìn)重金屬的吸收和抗生素的生物降解。有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)微生物帶的陰離子型基團(tuán)，在水溶液中呈負(fù)電性，能與土壤中帶正電荷的離子結(jié)合，通過氧化-還原作用或烷基取代作用等，使重金屬從一種狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N狀態(tài)，如Geospirillum bornseii在厭氧條件下，可以將As5+還原成As3+，促進(jìn)了As的淋溶[36]。在抗生素存在的環(huán)境中，微生物受到激活會分泌出一些降解酶，如β-內(nèi)酰胺酶等，進(jìn)而通過修飾或水解作用使抗生素失活和降解[37]。

3 結(jié)論

（1）利用伴礦景天修復(fù)重金屬和抗生素復(fù)合污染土壤，修復(fù)后土壤中重金屬Zn、Cd和Pb的總量顯著降低，As和Cr總量無明顯變化；土壤中四環(huán)素類抗生素，磺胺類的SMZ、SMM、SMD和喹諾酮類的OFC、EFC顯著下降。

（2）在種植植物后，土壤微生物數(shù)量和酶活性相應(yīng)增加，伴礦景天修復(fù)土壤變化幅度大于常規(guī)芹菜種植。

（3）重金屬Zn、Cd、Pb、As和大部分抗生素都與土壤細(xì)菌、脲酶和磷酸酶呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，復(fù)合污染抑制了土壤的生物活性，在植物修復(fù)下，隨著重金屬含量降低和抗生素的降解，土壤微生物數(shù)量、酶活性相應(yīng)提高，生物活性增強(qiáng)。