王效瑾，高 巍，趙 鵬，于沖沖，劉紅恩，聶兆君，秦世玉，李 暢

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南省土壤污染防控與修復(fù)重點實驗室，鄭州 450002）

鎘（Cadmium，Cd）作為人體非必需元素，是毒性最強的重金屬元素之一。當(dāng)土壤受到Cd污染后，Cd會在生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體從而引起慢性中毒[1]。因此，目前Cd引起的環(huán)境污染問題已經(jīng)受到了廣大學(xué)者的普遍關(guān)注[2]。

Cd在土壤-植物-人中的遷移是目前環(huán)境Cd污染及人類健康風(fēng)險研究的重點和熱點問題之一，植物對Cd的吸收與轉(zhuǎn)運則是解決問題的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前已有研究表明，植物對Cd的吸收、轉(zhuǎn)運和分布積累是一個動態(tài)的過程，包括根系的活化和吸收、木質(zhì)部的裝載和運輸以及韌皮部裝載和向籽粒中的進(jìn)一步轉(zhuǎn)運[3]。目前國內(nèi)外有關(guān)Cd對植物影響的研究多數(shù)集中在研究Cd對植物地上部分的影響方面，如抑制蒸騰作用，使葉片失綠，損壞光合系統(tǒng)，最終導(dǎo)致光合效率下降，影響作物的產(chǎn)量與品質(zhì)等[4-5]。而根系是植物的主要吸收器官[6]，其形態(tài)、生長和空間分布直接決定著植物對重金屬的吸收能力和吸收效率。研究表明，過量的Cd積累會抑制根系生長，從而降低Cd的吸收能力。因此，研究根系對重金屬脅迫的響應(yīng)對于揭示植物抵抗重金屬脅迫的機理具有重要意義。而小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物，也是世界上覆蓋最廣的糧食作物，研究Cd在小麥體內(nèi)吸收和運轉(zhuǎn)機制，對于保障食品安全、實現(xiàn)糧食作物可持續(xù)生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。因此，本文研究了在不同濃度的Cd脅迫下小麥幼苗根系形態(tài)的變化和Cd吸收動力學(xué)，以期了解Cd在小麥體內(nèi)吸收和轉(zhuǎn)運的過程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為河南省廣泛種植的百農(nóng)207。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2017年12月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院樓光照培養(yǎng)室進(jìn)行。試驗選擇大小一致、圓潤飽滿的小麥種子，用自來水沖洗數(shù)次后，用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗3次，之后再用去離子水浸泡12 h，將吸脹后的種子擺放于塑料盆中的尼龍網(wǎng)上，每盆約300粒，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)（溫度25℃±1℃，濕度75%±1%，光照時間12 h），待小麥幼苗長至一葉一心時，選擇長勢一致的幼苗移入2 L含有2.0 mmol· L-1Ca（NO3）2· 4H2O，3.0 mmol· L-1KNO3，0.5 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O，1.0 mmol·L-1MgSO4·7H2O，50 μmol·L-1EDTA-Fe，23 μmol·L-1H3BO3，4.5 μmol·L-1MnCl2·4H2O，0.15 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.4 μmol·L-1ZnSO4·7H2O 和 0.045 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O 的營養(yǎng)液的塑料盆中培養(yǎng)。第一周使用半強度的營養(yǎng)液，之后用全強度的營養(yǎng)液培養(yǎng)。待小麥幼苗長至2葉1心時（移苗后一周左右），添加不同的Cd處理。

本試驗Cd2+處理濃度為0.5、5、50、200 μmol·L-1，Cd源為CdCl2·2.5H2O，以Cd2+處理濃度0 μmol·L-1為對照。每個處理重復(fù)3次，每3 d更換1次營養(yǎng)液。

1.3 測定方法

1.3.1 生長指標(biāo)的測定

在Cd處理0、3、6、11、17、23 d，分別收獲植株，將根系和地上部分分開，用刻度尺（最小分度單位為mm）測定株高和根長。用刻度尺測量根頸部至幼苗頂端葉尖，即為株高；測量根尖到幼苗莖基部的長度，即為根長[7]。

1.3.2 根系形態(tài)的測定

在Cd處理后第3、6、11、17、23 d后，分別收獲植株，將根系和地上部分分開，根系用EPSON全自動掃描儀掃描記錄小麥的根系形態(tài)并獲取根系圖像，然后采用WinRHIZO 2009根系掃描分析系統(tǒng)（加拿大）分析得出小麥幼苗的總根長、根總表面積、根體積、平均直徑和根尖數(shù)等。

1.3.3 根系橫切面解剖結(jié)構(gòu)的觀察

在Cd處理后第17 d時，取距根尖10 cm處的2 cm長度的主根，置于裝有FAA固定液（40%甲醛∶冰乙酸∶70%酒精=1∶1∶18）的2 mL離心管中固定過夜，之后用OCT包埋劑包埋24 h，然后在-20℃的環(huán)境下利用冷凍切片機對根尖進(jìn)行橫向切片，切片厚度為35μm，切片后將其附在載玻片上，放在玻片盒中。在-20℃的條件下冷凍干燥3 d，樣品凍干后，用熒光顯微鏡對根尖切片進(jìn)行觀察。

1.3.4 干質(zhì)量、Cd含量的測定

在Cd處理后第0、3、6、11、17、23 d每盆取3株樣品，將其地上部分和根分開，根系用20 mmol·L-1Na2-EDTA浸泡15 min，以除去表面吸附的Cd2+[8]，然后用去離子水漂洗、瀝干后，和地上部分放在烘箱中105℃殺青30 min，70℃下烘干至恒質(zhì)量，然后稱量，記錄地上部分和根系的干質(zhì)量（DW），并進(jìn)行Cd含量的測定。

干質(zhì)量的測定:將根系和地上部洗凈擦干后分別裝入紙袋中，用烘箱烘干至恒質(zhì)量，在萬分之一的電子天平上測定干質(zhì)量。

Cd含量測定:參照Zhao等[9]的方法。稱取適量干樣，用硝酸-高氯酸混合酸（體積比為4∶1）消煮完全，用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的HNO3定容到25 mL容量瓶中，用火焰原子吸收分光光度計（ZEEnit 700；Analytik Jena AG，德國）測定Cd含量。

Cd在植物體內(nèi)由根系向地上部分轉(zhuǎn)運的轉(zhuǎn)運系數(shù)（TF）、富集系數(shù)（BCF）及根冠比按下列公式計算:

富集系數(shù)=植株Cd含量（mg·kg-1）/溶液中Cd含量（mg·kg-1）

轉(zhuǎn)運系數(shù)=植株地上部Cd含量（mg·kg-1）/植株地下部Cd含量（mg·kg-1）

根冠比=根部干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用DPS進(jìn)行方差分析（ANOVA），使用Sigmaplot 10.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd處理對小麥幼苗生長指標(biāo)的影響

株高、根長、干物質(zhì)質(zhì)量等指標(biāo)是衡量小麥幼苗生長的重要指標(biāo)。為了解不同Cd濃度處理對小麥幼苗生長的影響，在試驗中測定了小麥幼苗的株高、根長和干物質(zhì)量（圖1）。

圖1 Cd處理對小麥幼苗生長指標(biāo)的影響Figure 1 Effect of Cd treatment on growth index of wheat seedling

由圖1可以看出，在低濃度（0.5 μmol·L-1和5μmol·L-1）Cd處理條件下，與0 d時相比，小麥幼苗在6 d時的根長增加了59.48%和51.22%，與6 d時相比，23 d的根長增加了136.43%和138%。低濃度Cd處理下，小麥幼苗的根長在0～6 d時的增加速率低于6～23 d。在高濃度（50 μmol·L-1和200 μmol·L-1）Cd處理下，小麥幼苗根長的增加幅度則與低濃度Cd處理下的增加幅度相反，6～23 d的根長增加幅度（16.46%和2.41%）低于0～6 d（23.7%和13.44%）。各個Cd濃度處理下株高的趨勢與根長的相似。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為高濃度的Cd處理使小麥幼苗的株高和根長的生長受到嚴(yán)重的抑制作用。在Cd50水平下，小麥幼苗的根冠比較低，且隨著時間的增加呈下降趨勢，說明此條件下小麥幼苗的根系生長受到的毒害比地上部嚴(yán)重。

在試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)在受到高濃度（50、200μmol·L-1）Cd處理11 d后，小麥幼苗根系發(fā)黑，下部葉片的葉梢開始發(fā)黃干枯，生長比較遲緩。幼苗在第11 d開始出現(xiàn)表型差異，表明Cd對植物的危害是一個緩慢的過程，短時間內(nèi)受到的毒害作用不明顯，隨著處理時間的增加，毒害作用不斷累積增強。在Cd處理后第23 d時，小麥幼苗根系及地上部分生物量均為:Cd0＞Cd0.5≈Cd5＞Cd50＞Cd200。

2.2 Cd處理對小麥幼苗吸收和轉(zhuǎn)運的影響

圖2 Cd處理對小麥整株Cd積累量、Cd含量、轉(zhuǎn)運系數(shù)和富集系數(shù)的影響Figure 2 Effects of cadmium treatment on cadmium accumulation，cadmium content，transport coefficient and enrichment coefficient of wheat

小麥幼苗的整株Cd積累量是幼苗的整株干質(zhì)量與其整株Cd含量的乘積。由圖2可以看出，隨著Cd處理時間的增加，小麥幼苗整株的Cd積累量是逐漸增加的。Cd濃度為0～0.5 μmol·L-1時，小麥幼苗地上部和根部的Cd含量在第6 d時達(dá)到峰值。第6 d后，雖然小麥幼苗整株Cd積累量是增加的，但其地上部和根部Cd含量均下降，可能是由于小麥幼苗生物量的增長速度大于體內(nèi)Cd積累的速度，構(gòu)成生物稀釋效應(yīng)。小麥幼苗在50 μmol·L-1和 200 μmol·L-1Cd處理11～23 d時，地上部和根部的Cd含量顯著高于0.5 μmol·L-1和5 μmol·L-1Cd處理（P＜0.05）。且在相同Cd水平下，小麥幼苗根部的Cd含量是遠(yuǎn)高于地上部的，大約為2～17倍。

轉(zhuǎn)運系數(shù)是反映植物不同部位間重金屬遷移能力大小的指標(biāo)。Cd處理濃度為0.5 μmol·L-1時，Cd在小麥中的轉(zhuǎn)移系數(shù)為0.16～0.25，顯著高于其他處理。在Cd處理后11～23 d，Cd在小麥幼苗中的轉(zhuǎn)移系數(shù)為Cd0.5＞Cd5≈Cd50≈Cd200，表明 Cd處理會抑制 Cd從根系向地上部分的轉(zhuǎn)移，這可能與小麥幼苗的生長在Cd處理下受到抑制，以致減少了隨蒸騰流向地上部轉(zhuǎn)運Cd2+的量有關(guān)。

圖3 Cd處理對小麥幼苗根系形態(tài)參數(shù)的影響Figure 3 Effect of Cd treatment on root morphological parameters of wheat seedling

富集系數(shù)表示重金屬向植物體內(nèi)遷移的難易程度，是表征植物對重金屬吸收能力的一項重要評價指標(biāo)。從圖2可以看出，不同Cd濃度下，Cd在小麥幼苗中的富集系數(shù)為Cd0.5＞Cd5＞Cd50＞Cd200，表明小麥對Cd的吸收能力與Cd處理濃度成反比關(guān)系。Cd濃度為0.5μmol·L-1時，小麥幼苗富集系數(shù)為0.63～1.53，在第6 d達(dá)到吸收最大值。在所有Cd處理中，小麥在Cd0.5時吸收和轉(zhuǎn)運Cd的能力是最強的。與Cd0.5處理相比，Cd5、Cd50和Cd200處理后吸收能力分別下降了69.56%、92.21%和97.30%，轉(zhuǎn)移能力分別下降了30.18%、24.68%和30.98%。

2.3 Cd處理對小麥幼苗根系形態(tài)參數(shù)的影響

根系直接與土壤接觸，是植物與土壤環(huán)境接觸的重要界面，土壤中Cd對植物的危害首先會表現(xiàn)在根系的變化上。根生長的好壞，直接制約著地上部分的生長和產(chǎn)量的高低。根長是描述根系吸收水分和養(yǎng)分能力的重要參數(shù)之一。根體積大小是反映根系生長發(fā)育狀況的重要指標(biāo)。根系直徑是根系與環(huán)境介質(zhì)直接接觸的重要指標(biāo)。小麥幼苗在重金屬Cd處理下的根系形態(tài)的變化與超積累植物相比有所不同。

圖3結(jié)果顯示，在各個Cd濃度的處理下小麥幼苗的總根長、根體積和總根尖數(shù)在測定的時間段內(nèi)基本都低于空白組，且在Cd處理后11～23 d，與對照相比，在Cd濃度為5～200 μmol·L-1時，幼苗的總根長和總根尖數(shù)降低顯著（P＜0.05），分別降低了46.51%～82.69%和48.52%～93.71%。這說明Cd處理會對小麥幼苗根系的吸收能力產(chǎn)生抑制作用。在Cd處理11 d后，小麥幼苗的根體積隨著Cd濃度的增加降低了11.72%～73.74%，說明小麥幼苗的根系生長受到了嚴(yán)重的毒害作用。隨著Cd處理時間的增加，各個Cd處理濃度下的小麥幼苗根系的平均直徑總體上是增加的，這可能是小麥根系對Cd處理的響應(yīng)。

2.4 根系形態(tài)參數(shù)與小麥幼苗Cd吸收和轉(zhuǎn)運能力的相關(guān)性分析

為了研究小麥幼苗根系形態(tài)對Cd吸收、轉(zhuǎn)運的影響，本文對測定的小麥幼苗的根系形態(tài)參數(shù)與轉(zhuǎn)運系數(shù)、富集系數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，見表1。

由表1可知，小麥幼苗的根系形態(tài)參數(shù)中，僅根平均直徑與轉(zhuǎn)運系數(shù)、富集系數(shù)都具有相關(guān)性，且相關(guān)性較強。小麥幼苗對Cd的吸收能力（即富集系數(shù)）與根平均直徑呈顯著正相關(guān)，且小麥幼苗中Cd向地上部的轉(zhuǎn)移能力與根平均直徑呈顯著負(fù)相關(guān)，這說明在根系參數(shù)中，根直徑對小麥Cd的吸收及轉(zhuǎn)運都起著非常重要的作用。

2.5 Cd處理對小麥幼苗根系的熒光觀察

根系掃描圖片（圖4A至圖4C）顯示小麥幼苗在5、50μmol·L-1Cd處理17 d后根系形態(tài)與空白對照相比發(fā)生顯著變化。為了進(jìn)一步研究根系是如何應(yīng)對Cd處理的響應(yīng)，進(jìn)行了小麥根系橫切面的熒光顯微鏡觀察，如圖4D至圖4F所示。木質(zhì)素具有自發(fā)熒光，在紫外光激發(fā)后可發(fā)射出較強的熒光信號。從圖4D至圖4F可以看出，相較于空白對照，Cd處理后可以誘導(dǎo)根直徑明顯增粗。5μmol·L-1Cd處理后，皮層細(xì)胞層數(shù)增多、細(xì)胞增大；內(nèi)皮層細(xì)胞數(shù)量、大小無明顯變化，但是熒光信號顯著加強；50μmol·L-1Cd處理后，中皮層和內(nèi)皮層的細(xì)胞數(shù)量有明顯增多，熒光信號明顯增強。熒光信號的增強，說明Cd誘導(dǎo)木質(zhì)素沉淀。

圖4 不同Cd處理下小麥根系切片熒光顯微鏡照片（×200倍）Figure 4 Fluorescence microscopy of wheat root sections under different cadmium treatments（×200 times）

表1 根系形態(tài)參數(shù)與小麥Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)和富集系數(shù)的相關(guān)性Table 1 Correlation between root morphological parameters and Cd transport coefficient and enrichment coefficient of wheat

3 討論

3.1 Cd處理對小麥幼苗生長指標(biāo)的影響

Cd污染是植物生長過程遭受逆境脅迫中最普遍的重金屬污染之一。Cd離子在土壤中的高度移動性致使其容易進(jìn)入植物體內(nèi)，累積到一定程度，會擾亂植物新陳代謝過程，從而對植物產(chǎn)生毒害[10]。其中生物量的變化程度可以反映出植物對Cd的耐性情況[11]，在本研究中，與對照（CK）相比，不同濃度Cd處理中小麥幼苗生長受到了不同程度的影響。本試驗結(jié)果表明，在同一Cd處理時間下，施用低濃度（0.5、5μmol·L-1）Cd對根和地上部生物量以及株高和根長各項生長指標(biāo)的影響不顯著，說明在低濃度Cd處理時，小麥幼苗對其有一定程度的耐性。而在高濃度（50、200 μmol·L-1）Cd處理時，隨著Cd濃度的增加，根和地上部生物量以及株高和根長均顯著降低（P＜0.05）。并且隨著處理時間延長，抑制程度加重。說明在高Cd濃度處理下，小麥幼苗受Cd毒害嚴(yán)重，生長緩慢。高濃度Cd處理抑制了小麥的生長，而由于植物組織的生長抑制和生物量的下降是細(xì)胞死亡的必然結(jié)果，因而揭示了Cd對小麥生長和生物量的抑制作用可能和其導(dǎo)致了細(xì)胞死亡有關(guān)[12]。

3.2 Cd處理對小麥幼苗根系形態(tài)的影響

根系是植物體進(jìn)行吸收和代謝的主要器官，在響應(yīng)環(huán)境變化方面表現(xiàn)出高度的發(fā)育可塑性[13]，植物根系形態(tài)可塑性是其在特定環(huán)境下生存策略的重要表現(xiàn)[14]。重金屬脅迫嚴(yán)重影響著植物根系的發(fā)育[15]，而根系形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化反過來會影響根系對Cd吸收和木質(zhì)部的裝載效率，從而影響Cd在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和積累[16-18]。

本試驗研究結(jié)果表明，高濃度Cd處理下，小麥幼苗的根長、根體積和總根尖數(shù)是降低的，但是根系的平均直徑是逐漸增加的。這些數(shù)據(jù)與Ostonen等[19]的論點基本一致，其研究表明Cd脅迫下花生的根長、根表面積、根體積和總根尖數(shù)下降，根系平均直徑增加。Cd處理誘導(dǎo)小麥幼苗根尖數(shù)量減少，表明側(cè)根的形成可能被Cd抑制[20]，這也是植物對重金屬脅迫的重要響應(yīng)。植物的根尖是吸收的重要部位[21]，因此在Cd處理條件下根尖的數(shù)量減少意味著小麥幼苗吸收養(yǎng)分的能力下降。Cd處理導(dǎo)致的根表面積減少，也會使小麥根系吸收養(yǎng)分能力減弱，從而對其生長造成影響[22]。

本試驗相關(guān)性分析結(jié)果表明，根直徑對小麥Cd的吸收及轉(zhuǎn)運都起著非常重要的作用，且根系平均直徑與Cd濃度成正比關(guān)系。Cd在小麥體內(nèi)的運輸依次經(jīng)過表皮、皮層，穿過內(nèi)皮層到達(dá)維管組織，小麥的“馬蹄形”加厚結(jié)構(gòu)可有效阻止Cd的質(zhì)外體運輸，并使得Cd在穿過加厚結(jié)構(gòu)后，共質(zhì)體途徑成為其主要運輸途徑[23]。目前有研究表明，植物可以將Cd吸持到非活性部位以降低Cd的毒害，通過細(xì)胞壁的固持阻擋Cd進(jìn)一步進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[24]。本試驗根系橫切面熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，5μmol·L-1Cd處理可誘導(dǎo)皮層細(xì)胞層數(shù)增多、薄壁細(xì)胞增大，從而使得皮層細(xì)胞可容納更多Cd，減緩Cd的向內(nèi)運輸；50μmol·L-1Cd處理可誘導(dǎo)皮層和內(nèi)皮層薄壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，厚壁細(xì)胞壁木質(zhì)素進(jìn)一步沉積，熒光信號增強[25]。木質(zhì)素的沉淀可提高細(xì)胞壁結(jié)合重金屬離子的能力，避免其過多地進(jìn)入原生質(zhì)體，危害細(xì)胞的生長發(fā)育[26]。

4 結(jié)論

重金屬Cd對小麥幼苗生長狀況、根系形態(tài)和吸收、轉(zhuǎn)運Cd存在較為明顯的劑量效應(yīng)。施用低濃度Cd對小麥幼苗的根和地上部生物量以及株高和根長各項生長指標(biāo)的影響不顯著。本試驗中在Cd濃度為0.5μmol·L-1時，小麥幼苗的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)均為最大，說明此濃度下小麥幼苗對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運能力是最強的。高濃度的Cd處理下，小麥幼苗的根長、根體積和總根尖數(shù)逐漸降低，而根系平均直徑逐漸增加，說明根平均直徑的增加可能是小麥根系對Cd處理的響應(yīng)。且相關(guān)性分析結(jié)果表明:Cd處理后根系平均直徑的增粗對小麥Cd的吸收及轉(zhuǎn)運都起著非常重要的作用。