楊 姝，祖艷群，李 博，畢玉芬，何永美，賈 樂，李 元*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學理學院，昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學與技術(shù)學院，昆明 650201）

由于采礦業(yè)、汽車工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，目前我國土壤鎘（Cd）污染問題較為嚴峻，其點位超標率達7.0%，在8種無機污染物中位列第一[1]。重金屬Cd是一種植物非必需元素[2]，在較低水平下就能影響植物的生長及生理生化過程[3]。氮代謝是植物的重要生理過程之一，決定了植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。Cd脅迫會影響植物的氮代謝過程[7]，導致硝酸還原酶（NR）活性受到抑制[5]，進而減緩硝態(tài)氮的同化過程[6]。Cd脅迫也會影響谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性[7-8]，從而導致氨態(tài)氮含量的變化[9]及一系列連鎖反應，包括株高和生物量的變化[10]。此外也發(fā)現(xiàn)，一些氮代謝產(chǎn)物如脯氨酸、GSH和PCs在植物的Cd耐性方面起著非常重要的作用[11]。

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是一種優(yōu)良牧草，其氮代謝過程會受Cd脅迫的影響[12]。如Cd脅迫降低了“甘農(nóng)3號”苜蓿籽苗中可溶性蛋白的含量[13]。對葉片中脯氨酸含量的研究表明，隨著Cd脅迫濃度的增加，“新疆大葉”苜蓿的脯氨酸含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢[14]，而在相同Cd濃度的脅迫下，“新疆大葉”的脯氨酸含量大于“阿爾岡金”[15]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿的氮代謝過程與其產(chǎn)量和品質(zhì)有相關(guān)性[4]，表明氮代謝過程的Cd耐性可能是紫花苜蓿Cd耐性的一個重要表現(xiàn)方面。

本研究以20個紫花苜蓿品種為植物材料，以Cd脅迫前后11個氮代謝相關(guān)指標的變化率作為分析的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，應用主成分分析法和隸屬函數(shù)法得到綜合評價值并對20個品種氮代謝的Cd耐性進行評估，同時利用多元線性回歸法構(gòu)建各單項指標與綜合評價值之間的數(shù)學模型，篩選出最能體現(xiàn)氮代謝Cd耐性的評價指標，以構(gòu)建紫花苜蓿氮代謝Cd耐性的評價體系，為篩選紫花苜蓿的耐Cd品種及Cd污染土壤的治理及綜合利用提供研究材料和研究模型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

盆栽用土壤取自昆明市云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場（25°14′30″N，102°56′27″E），紅壤土，pH值6.83，有機質(zhì)含量為30.18 g·kg-1，全氮含量為2.68 g·kg-1，堿解氮含量為56.73 mg·kg-1，全磷含量為14.21 g·kg-1，速效磷含量為 82.83 mg·kg-1，全鉀含量為 16.06 g·kg-1，速效鉀含量為521.76 mg·kg-1，總Cd含量0.38 mg·kg-1，土壤過篩備用。選用的紫花苜蓿品種如表1所示，由云南農(nóng)業(yè)大學動科院草業(yè)科學實驗室提供，挑選大小一致且籽粒飽滿的種子，用10%H2O2進行表面消毒10 min，再用蒸餾水沖洗多次后晾干備用。

1.2 試驗設計

使用圓形塑料花盆（高45 cm，口內(nèi)徑40 cm），每盆裝土9 kg，在土壤中加入研成粉末狀的CdCl2·2H2O拌勻，使土壤Cd含量分別為0（CK）和50 mg·kg-1。按10 g·盆-1的量加入生石灰粉末拌勻調(diào)節(jié)土壤pH值至中性。按5 g·盆-1的量施入復混通用肥（N 10%，P2O510%，K2O 5%）作為底肥，用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量至最大持水量的60%左右，平衡兩周。按8粒·盆-1的播種量，將苜蓿種子均勻撒播于盆內(nèi)，待出苗至株高10 cm時，每盆留5株，其余間去。生長期間常規(guī)管理，待生長至100 d時進行指標測定。每個處理設3個重復，共計120盆，隨機排列放置于云南農(nóng)業(yè)大學溫室大棚。

表1 苜蓿品種名稱及來源Table 1 Origin and name of alfalfa varieties

1.3 取樣與測定

待植株生長至100 d時，測定株高。以盆為單位收獲植株，用蒸餾水洗凈晾干表面水分后，測定其生物量。葉片鮮樣中氮代謝關(guān)鍵酶（NR、GS、GOGAT、GDH）活性使用酶活性測定試劑盒（Solarbio，北京索萊寶科技有限公司）測定。葉片鮮樣中硝態(tài)氮含量采用5%硫酸-水楊酸提取比色法測定[4，11]，總游離氨基酸采用茚三酮溶液顯色法測定[16]，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法測定[17]，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定[18]。整株鮮樣放入真空干燥箱內(nèi)105℃殺青30 min，而后將溫度調(diào)至70℃烘至恒質(zhì)量，研磨干樣至粉末狀并過篩后，使用凱式定氮法測定植株總氮含量[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進行常規(guī)計算及分析，相關(guān)性分析、主成分分析和多元線性回歸分析采用SPSS軟件處理。

式中，RCi為第i個品種在Cd脅迫下的指標變化率。Uij為第i個品種在j公因子中的隸屬函數(shù)值，Cij表示第i個品種在第j個公因子中的得分，Cmin表示所有品種在第j個公因子中的最小得分，Cmax表示所有品種在第j個公因子中的最大得分。Wj為第j個公因子的權(quán)重系數(shù)，Pj為第j個公因子的貢獻率。Di為第i個品種的綜合評價值。下標i表示受試紫花苜蓿品種的編號，取值為1，2，3，…20，下標j指主成分分析提取的公因子數(shù)（主成分數(shù)），在本論文中的取值為1、2。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下紫花苜蓿氮代謝指標的變化率

在外源添加Cd濃度為50 mg·kg-1時，與對照相比，20個紫花苜蓿品種的株高、生物量、氮含量、氮代謝酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量、脯氨酸含量和硝態(tài)氮含量等11個指標均有不同程度的變化（圖1）。其中，株高增加最大的品種是“巨人”（58.18%），而減少最大的品種是“中苜1號”（-24.94%）。從生物量看，增加和降低幅度最大的品種分別是“新牧2號”（58.64%）和“游客”（-21.04%）。結(jié)果顯示，全氮含量的變化范圍在16.04%～-30.01%之間，增加最大的品種為“苜蓿王”，而減小最大的品種為“多葉”。從可溶性蛋白含量看，品種“德欽”增加最多，增幅達36.18%，而品種“四季旺”降幅最大，達-34.85%。各品種游離氨基酸含量也有較大變化，其中增幅最大品種是“前景”，達49.60%，而降幅最大品種為“多葉”，達-45.52%。脯氨酸含量的變化范圍為89.63%～-35.76%，最大增幅和降幅的品種分別為“國產(chǎn)”和“中苜1號”。硝態(tài)氮含量變化幅度也較大，其中增幅最大和降幅最大的品種為“WL525HQ”和“金皇后”，其值分別達122.24%和-68.30%。氮代謝關(guān)鍵酶NR、GS、GOGAT和GDH活性的指標變化率范圍分別為66.68%（新牧2號）～-83.00%（WL525HQ）、76.36%（草原1號）～-45.71%（三得利）、97.79%（國產(chǎn)）～-73.22%（游客）和75.44%（國產(chǎn)）～-74.97%（WL525HQ）。

2.2 各氮代謝指標間的相關(guān)性分析

分析20個紫花苜蓿品種在Cd脅迫下各項指標變化率的相關(guān)性（表2）。結(jié)果顯示，在株高、生物量、全氮含量、NR活性和GOGAT活性這5個指標之間，兩兩均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），GS活性與可溶性蛋白含量、脯氨酸含量之間互呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。而硝態(tài)氮含量則與株高、生物量、全氮含量、游離氨基酸含量、NR活性、GS活性和GOGAT活性呈極顯著負相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和GDH活性呈顯著負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。此外，GDH活性與GOGAT活性之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與全氮含量、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量和脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

2.3 主成分分析

使用SPSS軟件對20個品種中11個指標的變化率進行主成分分析并提取關(guān)鍵因子（表3）。結(jié)果表明，第一主成分的特征根為7.376，貢獻率達67.053%，第二主成分的特征根為1.007，貢獻率為9.158%，從第三主成分開始，其特征根均小于1。第一和第二主成分的累積貢獻率達76.212%，已大于75%，因此可將原有的11個指標降維整合為2個因子，這兩個因子是新的相互獨立的綜合指標，能概括原始指標攜帶的絕大部分信息。

由成分得分系數(shù)發(fā)現(xiàn)（圖2），主成分1的值與指標株高、生物量、全氮、NR和GS呈正相關(guān)關(guān)系，而與指標游離氨基酸、可溶性蛋白、脯氨酸、硝態(tài)氮、GOGAT和GDH呈負相關(guān)關(guān)系，其中株高、生物量和GDH的載荷較大，分別為0.329、0.306和-0.327。主成分2的值與全氮、可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸、硝態(tài)氮、NR、GOGAT和GDH呈正相關(guān)關(guān)系，而與株高、生物量和GS活性呈負相關(guān)關(guān)系，其中可溶性蛋白、游離氨基酸和GDH的載荷較大，分別為0.247、0.293和0.512。

圖1 Cd脅迫下20個紫花苜蓿品種的指標變化率Figure 1 Index change rates of 20 alfalfa cultivars under Cd stress

表2 Cd脅迫下20個紫花苜蓿氮代謝相關(guān)指標變化率的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of indicators change rate in nitrogen metabolism of 20 alfalfa cultivars under Cd stress

表3 主成分的特征根和貢獻率Table 3 Eigenvalue and contribution rates of principal components

2.4 Cd耐性綜合評價

根據(jù)成分得分系數(shù)，各品種在兩個因子中的分值（Cij）計算函數(shù)分別為:

Ci1=0.329×株高+0.306×生物量+0.004×全氮-0.065×可溶性蛋白-0.113×氨基酸-0.021×脯氨酸-0.223×硝態(tài)氮+0.164×NR+0.295×GS-0.009×GOGAT-0.327×GDH

Ci2=-0.210×株高-0.182×生物量+0.180×全氮+0.247×可溶性蛋白+0.293×氨基酸+0.200×脯氨酸+0.092×硝態(tài)氮+0.001×NR-0.187×GS+0.189×GOGAT+0.512×GDH

圖2 氮代謝相關(guān)指標的成分得分系數(shù)Figure 2 Component score coefficient of nitrogen metabolismrelated indicators

利用公式（3）得出主成分1和主成分2的權(quán)重系數(shù)分別為0.880和0.120。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)公式（2）和（4）計算出各品種的隸屬函數(shù)值（Uij）和綜合評價值（Di）（表4）。結(jié)果顯示，在20個品種中，“巨人”的Di值最大，為0.89，表明其氮代謝具有最強的耐Cd性。其后依次為“金皇后”“新牧2號”“草原1號”“維多利亞”和“隴中苜?！?，它們的D值分別為0.87、0.84、0.81和0.80，說明它們的氮代謝均具有相對較高的耐Cd性。而“三得利”“WL525HQ”“四季旺”和“游客”幾個品種的Di值均小于0.1，表明其氮代謝對Cd的脅迫較為敏感。

2.5 D值的回歸模型及評價指標篩選

為分析各指標變化率與試驗品種Cd耐性間的關(guān)系，篩選較為可靠的紫花苜蓿Cd耐性鑒定指標，以Cd耐性綜合評價值（D）作為因變量，把在Cd脅迫下各單項指標的變化率視為自變量，開展多元線性逐步回歸分析，得到相應的回歸方程:

表4 20個紫花苜蓿品種氮代謝指標的主成分得分和綜合得分Table 4 Principal component scores and synthesis score of 20 alfalfa cultivars

D=0.331+0.002×株高+0.002×GS-0.002×GDH-0.002×硝態(tài)氮+0.001×NR+0.003×生物量

其中，方程決定系數(shù)R2=0.999，P=0.000。從方程中發(fā)現(xiàn)，株高、GS、GDH、硝態(tài)氮、NR和生物量這6個指標對D值有顯著影響，即這6個指標的變化率能較好體現(xiàn)紫花苜蓿氮代謝對Cd脅迫的耐性，通過該方程計算Cd耐性綜合評價值（D），可初步預測不同紫花苜蓿品種氮代謝對Cd脅迫的耐性。

3 討論

研究表明，Cd脅迫下紫花苜蓿的株高、根長、根質(zhì)量、地上部質(zhì)量等指標會發(fā)生變化[20]，這種變化存在品種差異，一些耐性強的品種表現(xiàn)為增加，而一些耐性弱的品種表現(xiàn)為降低[21]。在本試驗中Cd脅迫導致9個品種的株高增加而11個品種的株高下降，生物量的變化趨勢與此相同，說明紫花苜蓿對Cd的耐性可較直觀地通過株高和生物量指標的變化率表現(xiàn)出來。在Cd脅迫下，植物的生長會因氮同化酶（NR、NiR、GS）活性受到抑制而減緩[14]，對紫花苜蓿的研究則發(fā)現(xiàn)其氮含量對其生物量的形成有著直接的影響[22]。在本試驗中，Cd處理后20個品種的株高變化率和NR、GS、GOGAT活性變化率均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），20個品種的生物量變化率和NR、GS、GOGAT活性變化率及總氮含量變化率之間也呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），這與前人研究結(jié)果相符。表明Cd脅迫對紫花苜蓿生長的影響可能是通過對氮代謝過程的影響來實現(xiàn)的。

脯氨酸、游離氨基酸和可溶性蛋白是氮代謝過程的重要代謝產(chǎn)物。通過抗脂質(zhì)過氧化、保護酶活性和維持生物膜完整性，脯氨酸能夠調(diào)節(jié)滲透壓以應對Cd脅迫[23]，本研究發(fā)現(xiàn)，20個品種的脯氨酸含量變化率與株高和生物量變化率均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），這也印證了Cd脅迫條件下，紫花苜?？赏ㄟ^體內(nèi)脯氨酸含量的增加來抵御Cd毒[18]。Cd脅迫也會影響植株中游離氨基酸和可溶性蛋白的含量[16，24]，游離氨基酸含量的增加有利于植物對逆境的抵御，可溶性蛋白含量的增加有助于維持細胞代謝的正常進行，還可能合成一類能與Cd特異結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽，從而減輕毒害[25]。在本試驗中，20個品種的游離氨基酸含量變化率與總氮含量變化率呈顯著相關(guān)（P＜0.01），可溶性蛋白含量變化率與株高、生物量和總氮含量變化率均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），也驗證了前人研究結(jié)果?？梢姡x過程產(chǎn)物脯氨酸、游離氨基酸和可溶性蛋白可作為考察紫花苜蓿Cd耐性的重要指標。在相同濃度的Cd脅迫下，Cd耐性強的品種其脯氨酸、游離氨基酸和可溶性蛋白含量相對較高。

氮代謝過程的Cd耐性是紫花苜蓿Cd耐性的一個重要表現(xiàn)方面。氮代謝過程的相關(guān)指標可作為評估紫花苜蓿Cd耐性的重要參考依據(jù)。氮代謝過程非常復雜，所涉及的指標也較多[8]，且指標與指標之間也存在著相互聯(lián)系和相互影響的關(guān)系，因此不能片面地采用某個單一指標對紫花苜蓿氮代謝的Cd耐性進行評估。只有將多個具有代表性的指標進行綜合分析，其結(jié)果才具有一定的說服力和可借鑒性[26]。主成分分析可將原來數(shù)量較多的單項指標轉(zhuǎn)換成新的個數(shù)較少且彼此獨立的綜合指標，進一步利用模糊數(shù)學的隸屬函數(shù)分析法求出各綜合指標評價值（D值）[27]，比較客觀地反映各參試品種的Cd耐性。在本實驗中，紫花苜蓿的11個氮代謝相關(guān)指標被轉(zhuǎn)換成2個新的相互獨立的綜合指標，這2個指標概括了原始指標攜帶的絕大部分信息，結(jié)合隸屬函數(shù)法，可以較為方便地對紫花苜蓿氮代謝的Cd耐性進行評估。

4 結(jié)論

氮代謝過程的Cd耐性可作為衡量紫花苜蓿Cd耐性的一個重要依據(jù)。11個氮代謝相關(guān)指標經(jīng)主成分分析降維為2個新的獨立的指標，以此計算得到的綜合評價值（D）顯示品種“巨人”和“三得利”分別具有最強和最弱的氮代謝Cd耐性。D值的線性回歸分析顯示株高、GS、GDH、硝態(tài)氮、NR和生物量6個單項指標可作為評價紫花苜蓿氮代謝Cd耐性的主要指標，為紫花苜蓿Cd耐性品種的篩選與鑒定提供依據(jù)和數(shù)學模型。