馬紅燕， 武文波， 張越誠， 田 銳， 張會芳

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，延安市分析技術(shù)與檢測重點實驗室，陜西延安 716000)

碳量子點(CQDs)是一種新型的碳納米功能材料，尺寸一般為1～10 nm，其具有生物毒性低、熒光穩(wěn)定、水溶性好、容易制備和生物相容性好等優(yōu)點[1]。目前CQDs的制備主要以人工制備的含碳化合物為原料，其制備過程繁瑣，反應(yīng)條件苛刻[2]。近年來，一些利用天然生物物質(zhì)，如楓樹葉[3]、枸杞[4]為原料制備CQDs的方法被相繼報道。

左旋多巴(Levodopa，LDOPA)是一種抗震顫麻痹類物質(zhì)，其經(jīng)過血腦屏障進入中樞，經(jīng)多脫羧酶變成多巴胺后產(chǎn)生作用，可用于治療帕金森綜合癥[5]?，F(xiàn)已報道測定LDOPA的方法，主要有薄層色譜法[6]、毛細管電泳法[7]、高效液相色譜法[8]、電化學(xué)發(fā)光法[9]和分光光度法[10 - 11]等。這些方法有的儀器設(shè)備昂貴，有的操作過程繁瑣，有的線性范圍窄、檢出限高。因此，進行LDOPA靈敏、準確、快速測定新方法的研究顯得尤為必要。

實驗發(fā)現(xiàn)，選用淀粉為碳源，通過一步水熱法可合成強熒光的CQDs。在研究淀粉CQDs發(fā)光性能的過程中，發(fā)現(xiàn)KMnO4的加入可使CQDs的熒光猝滅，熒光信號“關(guān)閉”；當(dāng)繼續(xù)加入LDOPA后，CQDs的熒光恢復(fù)為“打開”狀態(tài)，可構(gòu)建“關(guān)-開”型熒光探針，據(jù)此提出了基于CQDs熒光探針測定LDOPA的新方法。該方法成本低廉、靈敏度高、檢出限低。該研究為LDOPA的檢測提供了新方法，同時也拓展了CQDs的應(yīng)用范圍。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FLSP920型瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國，愛丁堡)；F-4500型熒光分光光度計(日本，日立)；IR Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀(日本，島津)；8453型紫外-可見分光光度計(美國，安捷倫)。

LDOPA溶液：準確稱取0.0237 g LDOPA對照品(中國藥品生物制品檢定所)，用10.0 mL 1.0 mol/L的HCl溶解后，以水定容到100 mL，濃度1.0×10-3mol/L，使用時逐級稀釋。KMnO4溶液：1.0×10-3mol/L。所用其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CQDs的合成稱取8.00 g淀粉于25 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，再加3.0 mL乙二胺、10.0 mL超純水后，于180 ℃恒溫加熱18 h，將反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，得深棕色溶液，經(jīng)濾紙粗過濾后，再用孔徑為0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液定容至100 mL容量瓶中，稀釋100倍后使用。

1.2.2 LDOPA的測定依次移取1.0 mL CQDs溶液，2.0 mL KMnO4溶液，2.0 mL 1.0 mol/L HCl，適量LDOPA 溶液于10 mL比色管中，用水稀釋至刻度，搖勻。60 ℃恒溫水浴加熱30 min，流水冷卻5 min，于熒光分光光度計上，在λex/λem=397/452 nm處測定體系的熒光強度F和試劑空白的熒光強度F0，其中光譜狹縫均為5.0 nm，并計算體系熒光強度變化ΔF(ΔF=F-F0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs光學(xué)性質(zhì)分析

2.1.1 CQDs的熒光光譜圖1為不同激發(fā)波長下CQDs的熒光光譜，由圖可知該CQDs的發(fā)射峰強度和位置具有激發(fā)波長依賴性。當(dāng)激發(fā)波長由380 nm增加到420 nm，發(fā)射波長由442 nm紅移至483 nm，熒光強度先增大后減小，當(dāng)激發(fā)波長為397 nm時，發(fā)射波長為452 nm，熒光強度達到最大。

2.1.2 CQDs的紅外光譜CQDs的紅外光譜圖如圖2所示，2 930 cm-1處可能是-CH2的特征吸收峰，2 360 cm-1處的吸收亦或是-C≡C、-CN等的伸縮振動，2 000 cm-1為R′-C≡C-R的吸收峰。1 648 cm-1可能為-C=O的特征吸收峰，1 558 cm-1處的吸收峰可能為-C=C-的伸縮振動。1 210 cm-1可能是C-OH的吸收峰也可能是酚的吸收峰。1 080 cm-1為C-N的伸縮振動吸收，而876 cm-1附近也有吸收峰，可能為C-C鍵骨架振動。由此分析得，該CQDs表面含有-OH、-C=O、-COOH等親水性基團，因此，CQDs具有良好的水溶性。

圖1 不同激發(fā)波長下CQDs的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of CQDs with different excitation wavelengths

圖2 CQDs的傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜圖Fig.2 The FT-IR spectrum of CQDs

圖3 CQDs的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectrum of CQDs

2.1.3 CQDs的紫外-可見吸收光譜圖3為CQDs的紫外-可見吸收光譜圖，CQDs在282 nm波長處有一中等強度的吸收峰，在353 nm處有一較強的吸收峰，此為CQDs典型的紫外-可見吸收峰，其歸因于共軛碳碳雙鍵的π-π*躍遷所形成[12]。

2.1.4 CQDs的熒光壽命和量子產(chǎn)率通過瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀對CQDs的熒光壽命進行測定，其加權(quán)平均熒光壽命[13]為7.26 ns。采用參比法，以硫酸奎寧為標(biāo)準物質(zhì)[14]，測得CQDs的熒光量子產(chǎn)率為10%。

2.1.5 CQDs“關(guān)-開”型熒光探針的構(gòu)建室溫下，掃描體系在激發(fā)波長λex=397 nm下的熒光光譜，如圖4(A)所示。KMnO4的加入對CQDs的熒光有明顯的猝滅作用，使其熒光信號“關(guān)閉”；LDOPA加入后，CQDs熒光恢復(fù)，熒光信號“打開”。在該激發(fā)波長下，LDOPA無明顯熒光，LDOPA與KMnO4的產(chǎn)物也無明顯熒光，LDOPA對CQDs的熒光也沒有直接的猝滅作用，故對實驗結(jié)果不會造成影響。由圖4(B)可知，CQDs的熒光信號恢復(fù)值隨著LDOPA濃度的增加有規(guī)律的增加，據(jù)此可用于LDOPA的測定。

圖4 (A)可行性實驗；(B)隨左旋多巴濃度增加熒光信號恢復(fù)圖Fig.4 (A) Feasibility of experiment;(B) Fluorescent signal recovery with increasing levodopa concentration

2.2 實驗條件優(yōu)化

2.2.1 酸度的影響研究了酸度對體系ΔF的影響，結(jié)果表明在2.0 mL 1.0 mol/L HCl中，體系熒光恢復(fù)值ΔF最大且穩(wěn)定。

2.2.2 CQDs用量的選擇試驗了0.5～5.0 mL CQDs溶液對ΔF的影響，結(jié)果表明CQDs溶液的用量為1.0 mL時，體系的ΔF達到最大值。

2.2.3 KMnO4用量的選擇KMnO4的濃度會直接影響檢測LDOPA的背景值和線性范圍。實驗研究發(fā)現(xiàn)，KMnO4的用量少，CQDs猝滅效率低，熒光背景高，LDOPA檢測的線性范圍窄。而隨著KMnO4濃度的增加，CQDs的猝滅作用加強。但是KMnO4濃度不能過大，若KMnO4濃度過大，加入的LDOPA會首先與游離的KMnO4反應(yīng)，會降低LDOPA的有效濃度，影響熒光恢復(fù)效率。綜合考慮，實驗選擇加入2.0 mL 1.0×10-3mol/L KMnO4溶液。

2.2.4 溫度、加熱時間和穩(wěn)定性實驗CQDs與KMnO4混合后，CQDs熒光猝滅信號至少在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。相比于CQDs-KMnO4體系的穩(wěn)定性，LDOPA加入后，CQDs-KMnO4-LDOPA體系信號的“打開”在常溫下進行的比較緩慢，故采用加熱來加快反應(yīng)速率。分別研究了不同加熱時間、不同溫度對ΔF的影響，結(jié)果表明在60 ℃恒溫水浴中加熱30 min后，熒光恢復(fù)程度達到最大。

2.3 共存物質(zhì)的影響

在選定的實驗條件下，研究了常見共存物對1.5×10-5mol/L LDOPA溶液測定結(jié)果的影響。相對誤差控制在±5%范圍內(nèi)，1 000倍的Ca2+、Mg2+、K+、Al3+、Ba2+、Zn2+、D -果糖、蔗糖、糊精、淀粉，500倍的葡萄糖、Ag+，50倍的Cu2+不干擾測定?？梢娫摲椒ň哂休^好的選擇性。

2.4 線性范圍、檢出限和精密度

在優(yōu)化的條件下，測定LDOPA濃度與ΔF之間的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)LDOPA濃度在1.0×10-7～1.5×10-5mol/L范圍內(nèi)時，熒光強度恢復(fù)值與其濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：ΔF=2.2×107c+29.30，相關(guān)系數(shù)r為0.9980，該方法的檢出限(3σ/k)為4.5×10-8mol/L。對濃度為1.5×10-5mol/L的LDOPA標(biāo)準溶液平行測定5次，其相對標(biāo)準偏差為1.3%。

2.5 樣品測定

隨機抽取同一批號的LDOPA藥片10片，準確稱取適量研磨后的粉末(相當(dāng)于0.0237 g LDOPA)用10.0 mL 1.0 mol/L HCl溶解，超聲10 min后移至100 mL的容量瓶中，以水定容，搖勻后靜置10 min，將其過濾，棄去初濾液，移取一定量續(xù)濾液，按照實驗方法測定，同時進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表1。其中樣品1購于北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號：161201，規(guī)格：250 mg；樣品2購自湖南恒偉藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號：湘01070005，規(guī)格：250 mg。

表1 樣品測定結(jié)果及回收率實驗(n=5)

2.6 反應(yīng)機理初探

將KMnO4溶液加入到CQDs后，CQDs的熒光發(fā)生強烈猝滅，體系熒光信號“關(guān)閉”；再將LDOPA加入上述CQDs-KMnO4體系中后，CQDs熒光得到恢復(fù)，體系的熒光信號呈“打開”狀態(tài)。推測其機理如下：KMnO4具有強的氧化性，當(dāng)KMnO4加到CQDs溶液中后，KMnO4通過與CQDs表面基團的作用而結(jié)合于CQDs表面，即KMnO4通過電子轉(zhuǎn)移的方式占據(jù)CQDs表面，使CQDs的表面激發(fā)態(tài)以一種非輻射電子轉(zhuǎn)移方式釋放其能量，CQDs的熒光猝滅，使得熒光信號“關(guān)”。當(dāng)LDOPA加入到CQDs-KMnO4體系中后，由于LDOPA強的還原性，更易于與KMnO4作用，把KMnO4從CQDs表面移除下來，熒光信號“開”，使CQDs的熒光得到恢復(fù)，其可能機理如圖5所示。

圖5 CQDs的熒光“關(guān)-開”機理圖Fig.5 The mechanism of CQDs quenching and fluorescence recover

3 結(jié)論

通過一步水熱法合成了CQDs并對其發(fā)光性能進行了研究。在HCl介質(zhì)中，基于LDOPA對被KMnO4已猝滅的CQDs的熒光有恢復(fù)作用，建立了高靈敏度“關(guān)-開”型熒光探針對LDOPA定量檢測的熒光分析新方法。該研究拓展了CQDs在藥物熒光分析中的應(yīng)用范圍，為臨床測定LDOPA提供了新方法。