李苗云,張佳燁,朱瑤迪,王小慧,趙改名,柳艷霞
(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,鄭州 450002)
產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)在環(huán)境中無處不在,如在土壤、水、食品、動物、人類等都能發(fā)現(xiàn)該菌的存在。C.perfringens為革蘭氏陽性厭氧菌,因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖類而產(chǎn)出大量的氣體以及可以形成莢膜而得名,主要導(dǎo)致腹瀉、腹痛等食源性疾病,C.perfringens是引起食源性腸胃炎最常見的病原菌之一。烹飪后不適當(dāng)?shù)睦鋮s和不合適的貯存溫度條件是導(dǎo)致大多數(shù)疾病暴發(fā)的主要原因[1]。目前防止該菌引起疾病的方法主要為使用抗生素及合成藥物,但由于較多副作用出現(xiàn),替代技術(shù)考慮在食品中使用天然抗菌化合物,例如香料和草藥[2-4]。
目前肉類食品中抑制C.perfringens生長的方法眾多,主要包括添加有機(jī)酸和有機(jī)酸鹽、細(xì)菌素、殼聚糖、植物提取物精油等,有機(jī)酸鹽(乳酸鈣、乳酸鈉、檸檬酸鈉和磷酸鈉鹽等)作為新型抑菌劑廣泛應(yīng)用于C.perfringens的安全控制。Saeed等發(fā)現(xiàn),檸檬酸鈉和二乙酸鈉混合液可以抑制C.perfringens生長[5];在體外抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)羅伊氏菌素、乳酸鏈球菌素、芽孢桿菌素等細(xì)菌素都可以抑制 C.perfringens的生長,但由于食品中內(nèi)源性蛋白酶可以降解細(xì)菌素,所以體內(nèi)效果不明顯[6];殼聚糖可以減少雞肉介質(zhì)中C.perfringens芽孢的數(shù)量[7],植物精油中的綠茶提取物和冬季香薄荷精油也可以顯著抑制C.perfringens生長[8]。
香辛料不僅可以增加食品色、香、味,而且還對多種微生物具有廣譜的抗菌性,目前國內(nèi)外已經(jīng)有許多通過香辛料精油抑制微生物生長的報道,例如肉桂醛,丁香酚,異硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate, AITC)和香菜酚可以抑制肉毒桿菌,金黃色葡萄球菌,大腸桿菌O157:H7和鼠傷寒沙門氏菌的生長[9-12]。香菜酚[13]對許多食源性病原體如大腸桿菌,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌,蠟狀芽孢桿菌,沙門氏菌和清酒乳桿菌的抗菌活性已得到充分研究[14-17]而目前,國內(nèi)外關(guān)于香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活性在肉制品中的應(yīng)用方面的研究較少,中國傳統(tǒng)肉制品如醬鹵等添加的輔料(如八角、大茴)對C.perfringens生長的影響尚不清楚。
人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural networks,ANN)是一種以模擬人類或動物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)行為特征,進(jìn)行分布式并行信息處理的算法數(shù)學(xué)模型[18],廣泛應(yīng)用于非線性建模、函數(shù)逼近、建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等領(lǐng)域。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基于誤差反饋,采用后向傳播算法,是目前應(yīng)用最為廣泛,最具成效的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之一。使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對微生物生長的建模,近年來也有所研究,如侯奇等[19]利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建李斯特氏菌的微生物生長模型,易甜等[20]采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測酸奶的貨架期等。本論文擬從常見的香辛料精油中篩選出對 C.perfringens有抑制作用的肉桂精油、艾草精油、茴香精油,通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存動力學(xué)模型,為快速進(jìn)行微生物風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。
1.1.1 原材料與精油
熟制雞胸肉:市售,熟制雞胸肉進(jìn)行15 min水蒸氣滅菌處理,每60 g一份,分裝備用。
肉桂精油,艾草精油,茴香精油,黑胡椒精油和姜精油:購自上海回恩國際貿(mào)易有限公司,精油濃度均為0.88 mg/mL。
產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124:購于ATCC菌種庫;
產(chǎn)氣莢膜梭菌C1:真空脹袋的鹽焗雞中分離所得。
1.1.3 試劑與培養(yǎng)基
胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG),亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂(SPS)培養(yǎng)基,均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、吐溫-80,均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
1.1.4 主要儀器
VORTEX-2GENIE渦旋振蕩器(美國ScientificIndustries公司);PX-1505H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械公司);T18 basic高速分散器(德國IKA公司);AW200SG厭氧工作站(英國ELECTROTEK公司)。
1.2.1 不同濃度的香辛料精油的配制
參考李京晶[21]方法,按表 1配置不同質(zhì)量濃度香辛料精油,均質(zhì)1 min,制得精油懸浮液。
表1 熟制雞胸肉中的香辛料精油的濃度Table 1 Concentration of spices essential oil in cooked chicken breast meat
1.2.2 培養(yǎng)基的制備
參考 SN/T 1538.1-2016[22],將 15~20 mL TSA(tryptose soya agar)和 TSC(tryptose sulfite cycloserine)培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿(90 mm)中,待培養(yǎng)基冷卻凝固,即制備好平板,待用;將FTG(fluid thioglycollate medium)液體培養(yǎng)基滅菌后,待用。
1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)物的制備
參考王小慧等[23]制備濃度為 108CFU/mL的C.perfringens初始菌液,稀釋至104備用。
1.2.4 細(xì)菌的計數(shù)
培養(yǎng)后雞胸肉取樣,每組2個平行,取200 μL于TSC平板進(jìn)行微生物測定(平板涂布法),每梯度做 2個平行,涂布完成,37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h,對平行試驗中同一稀釋度的3個平板上C.perfringens進(jìn)行菌落計數(shù)。
用 MATLAB軟件構(gòu)建 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[24-28]進(jìn)行C.perfringens生長/殘存模型預(yù)測。
1.3.1 數(shù)據(jù)歸一化和去歸一化處理
在運(yùn)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為某目標(biāo)值的預(yù)測時,為使網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練更加準(zhǔn)確,在訓(xùn)練之前將所有輸入資料進(jìn)行歸一化處理[23],是為了避免選擇許多與目標(biāo)值相關(guān)的輸入因子作為輸入值時所造成的巨大差異性,可以根據(jù)公式(1)將數(shù)據(jù)全部壓縮在0~1范圍內(nèi)。
式中kn為尺度化的值;k為原始資料;Amax和Amin分別為資料庫中的最大值和最小值。
本文將肉桂精油、艾草精油、茴香精油3種天然的香辛料精油的不同質(zhì)量濃度作為輸入?yún)?shù);對應(yīng)的熟制雞胸肉中C.perfringens(C1和ATCC13124)生長/殘存數(shù)作為目標(biāo)參數(shù);通過歸一化將資料數(shù)值變?yōu)?0到 1范圍內(nèi)。
文中選 6組試驗樣本進(jìn)行預(yù)測,并對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行返歸一化處理。
1.3.2 隱層神經(jīng)元函數(shù)的選取和算法優(yōu)化
采用的是含有一個隱含層的單輸入單輸出的雙層BP網(wǎng)絡(luò)作為預(yù)測模型。由于目前輸入輸出已確定因此網(wǎng)絡(luò)中隱含層神經(jīng)元的數(shù)目決定了實際問題的復(fù)雜程度以及對期望誤差,訓(xùn)練結(jié)果采用判定模擬值與預(yù)測值兩者之間相關(guān)性的決定系數(shù)R2、均方根誤差RMSE進(jìn)行評定。基于文獻(xiàn)中的經(jīng)驗公式[29],文中選取得隱層神經(jīng)元個數(shù)通過試驗比較得到數(shù)目為2。
該BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)使用列文伯格-馬夸爾特演算法[30-31],在程序中可以通過直接設(shè)定規(guī)則化性能函數(shù)及性能比來增進(jìn)網(wǎng)絡(luò)廣義化能力,且如果設(shè)定更大,則網(wǎng)絡(luò)將會花費(fèi)比提前停止法較長的時間來進(jìn)行收斂,經(jīng)過訓(xùn)練的樣本歸一化后則其網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)參數(shù)為trainlm函數(shù),最大的訓(xùn)練次數(shù)為5 000次,訓(xùn)練步長0.1,期望誤差為1×10-7,創(chuàng)建一個單向傳播的多層前向網(wǎng)絡(luò)。
應(yīng)用建立的不同濃度精油下熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存動力學(xué)模型求得的預(yù)測值,與測得的實際值進(jìn)行對比,采用偏差度(Af)和準(zhǔn)確度(Bf)來評價模型的可行性。
方程(2)和(3)中,N實測是試驗實際測得的C.perfringens數(shù)量,lgCFU/g;N預(yù)測是應(yīng)用 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型得到的與N實測同一濃度的 C.perfringens數(shù)量,lgCFU/g;n是試驗次數(shù)。
將樣本保存在一個矩陣中,從3個樣本中隨機(jī)挑取1個放入預(yù)測集,隨機(jī)訓(xùn)練集占總樣本的60.6%(120例),驗證樣本占32.5%(39例),預(yù)測樣本占32.5%(39例)。分別采用均方根誤差RMSE(公式4)和相關(guān)系數(shù)R2(公式(5))來評價模型驗證的精度。
采用2016bMATLAB數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析,所有的數(shù)據(jù)均為3個平行樣品測定3次的平均值。
2.1.1 模型構(gòu)建
香辛料精油對熟制雞胸肉中 C.perfringens具有抑制作用,在一定濃度范圍內(nèi),精油濃度越大,C.perfringens的最終濃度越?。徊捎?BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行非線性擬合,繪制出肉桂精油、艾草精油精油 3種精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的預(yù)測模型曲線。
圖1為3種香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens(ATCC13124和C1)生長/殘存模擬情況,依據(jù)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合曲線斜率判斷ATCC13124和C1隨濃度下降速率:當(dāng)精油濃度≤5.5 mg/mL時,ATCC13124隨肉桂精油和茴香精油濃度增加下降的速率大于C1;在相同濃度范圍內(nèi),ATCC13124隨艾草精油濃度增加下降的速率低于C1;當(dāng)精油濃度≥11 mg/mL時,ATCC13124隨肉桂精油和艾草精油濃度增加下降速率低于C1,尤其為肉桂精油曲線幾乎趨于平緩,不再發(fā)生變化,在相同濃度范圍內(nèi)ATCC13124隨茴香精油濃度增加下降速率高于C1;當(dāng)精油濃度≥22 mg/mL時,ATCC13124和C1隨肉桂精油濃度增加變化,趨勢趨于平緩,ATCC13124隨艾草精油濃度增加下降速率逐漸大于C1,ATCC13124隨茴香精油濃度增加下降速率逐漸減小,C1則相反。對比上述結(jié)果發(fā)現(xiàn),同一精油,對不同C.perfringens菌株ATCC13124和C1的抑制情況不同。
BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens ATCC13124和C1殘存情況結(jié)果:精油濃度為5.5 mg/mL時,ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數(shù)低于 7.00 lgCFU/g而在艾草精油和茴香精油中均大于7.00 lgCFU/g;精油濃度為11 mg/mL時,ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數(shù)低于7.00 lgCFU/g而在艾草精油和茴香精油中均大于7.00 lgCFU/g;精油濃度為22 mg/mL時,ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數(shù)低于5.00 lgCFU/g,ATCC13124和C1在艾草精油和茴香精油中均大于5.00 lgCFU/g。因此,對比同一濃度,肉桂精油中的C.perfringens殘存數(shù)較低,抑制作用比艾草精油和茴香精油明顯。
圖1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的預(yù)測模型Fig.1 Prediction models of C.perfringens in cooked chicken breast by BP neural network fitting different essential oils
2.1.2 模型評價
由表 2可知在不同精油下準(zhǔn)確度(Af)和偏差度(Bf),預(yù)測值和實測值之間的差異Af均接近于 1,介于 10%以內(nèi),預(yù)測值上下波動的幅度Bf的值不超過1%,因此基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立的不同香辛料精油對C.perfringens的生長/殘存動力學(xué)模型是可靠的。
表2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合不同精油對熟制雞胸肉中C.perfringens(ATCC13124、C1)菌的模型驗證指標(biāo)Table 2 BP neural network fitting model validation indicators of different essentbial oils for C.perfringens (ATCC13124, C1) in cooked chicken breast
通過交互驗證的方法對不同香辛料精油的濃度與C.perfringens生長/殘存數(shù)建立校正模型,然后通過獨(dú)立樣本對模型進(jìn)行魯棒性檢驗結(jié)果如圖2和表3所示:所構(gòu)建的模型的預(yù)測精度R2均大于0.917,擬合度高,其中針對ATCC13124,艾草精油的預(yù)測效果均最佳,訓(xùn)練集、預(yù)測集和驗證集R2分別為0.992、0.988、0.986,均方根誤差RMSE分別為0.197、0.197、0.200 CFU/g;對于C1,肉桂精油的預(yù)測模型效果最佳,訓(xùn)練集、預(yù)測集和驗證集 R2分別為 0.976、0.971和 0.970,均方根誤差 RMSE分別為0.271、0.272、0.279 CFU/g。
圖2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的模型驗證Fig.2 Model verification of C. perfringens in cooked chicken breast by BP neural network fitting different spices essential oils
表3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合添加精油時熟制雞胸肉中C.perfringens(ATCC13124、C1)的模型驗證評價指標(biāo)Table 3 BP neural network fitting model verification evaluation index of parameter resetting of C.perfringens (ATCC13124, C1) in cooked chicken breast meat when adding essential oil CFU·g-1
本研究應(yīng)用 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的生長/殘存曲線,R2均在0.922~0.992之間;對模型進(jìn)行魯棒性檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn) R2均在0.920以上,均方根誤差RMSE在0.200~0.640 CFU/g之間,預(yù)測值和實測值擬合效果較好。表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存情況有很好的預(yù)測效果;依據(jù)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合C.perfringens的生長/殘存生長率,同一精油,對不同 C.perfringens菌株ATCC13124和C1的抑制情況不同,顯示出差異性;對比同一濃度,發(fā)現(xiàn)肉桂精油中C.perfringens殘存數(shù)最低,抑制作用最強(qiáng)。