李苗云，張佳燁，朱瑤迪，王小慧，趙改名，柳艷霞

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450002）

0 引 言

產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）在環(huán)境中無處不在，如在土壤、水、食品、動物、人類等都能發(fā)現(xiàn)該菌的存在。C.perfringens為革蘭氏陽性厭氧菌，因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖類而產(chǎn)出大量的氣體以及可以形成莢膜而得名，主要導(dǎo)致腹瀉、腹痛等食源性疾病，C.perfringens是引起食源性腸胃炎最常見的病原菌之一。烹飪后不適當(dāng)?shù)睦鋮s和不合適的貯存溫度條件是導(dǎo)致大多數(shù)疾病暴發(fā)的主要原因[1]。目前防止該菌引起疾病的方法主要為使用抗生素及合成藥物，但由于較多副作用出現(xiàn)，替代技術(shù)考慮在食品中使用天然抗菌化合物，例如香料和草藥[2-4]。

目前肉類食品中抑制C.perfringens生長的方法眾多，主要包括添加有機(jī)酸和有機(jī)酸鹽、細(xì)菌素、殼聚糖、植物提取物精油等，有機(jī)酸鹽（乳酸鈣、乳酸鈉、檸檬酸鈉和磷酸鈉鹽等）作為新型抑菌劑廣泛應(yīng)用于C.perfringens的安全控制。Saeed等發(fā)現(xiàn)，檸檬酸鈉和二乙酸鈉混合液可以抑制C.perfringens生長[5]；在體外抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)羅伊氏菌素、乳酸鏈球菌素、芽孢桿菌素等細(xì)菌素都可以抑制 C.perfringens的生長，但由于食品中內(nèi)源性蛋白酶可以降解細(xì)菌素，所以體內(nèi)效果不明顯[6]；殼聚糖可以減少雞肉介質(zhì)中C.perfringens芽孢的數(shù)量[7]，植物精油中的綠茶提取物和冬季香薄荷精油也可以顯著抑制C.perfringens生長[8]。

香辛料不僅可以增加食品色、香、味，而且還對多種微生物具有廣譜的抗菌性，目前國內(nèi)外已經(jīng)有許多通過香辛料精油抑制微生物生長的報道，例如肉桂醛，丁香酚，異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate, AITC）和香菜酚可以抑制肉毒桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌O157：H7和鼠傷寒沙門氏菌的生長[9-12]。香菜酚[13]對許多食源性病原體如大腸桿菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，蠟狀芽孢桿菌，沙門氏菌和清酒乳桿菌的抗菌活性已得到充分研究[14-17]而目前，國內(nèi)外關(guān)于香辛料精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活性在肉制品中的應(yīng)用方面的研究較少，中國傳統(tǒng)肉制品如醬鹵等添加的輔料（如八角、大茴）對C.perfringens生長的影響尚不清楚。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural networks，ANN）是一種以模擬人類或動物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)行為特征，進(jìn)行分布式并行信息處理的算法數(shù)學(xué)模型[18]，廣泛應(yīng)用于非線性建模、函數(shù)逼近、建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等領(lǐng)域。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基于誤差反饋，采用后向傳播算法，是目前應(yīng)用最為廣泛，最具成效的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之一。使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對微生物生長的建模，近年來也有所研究，如侯奇等[19]利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建李斯特氏菌的微生物生長模型，易甜等[20]采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測酸奶的貨架期等。本論文擬從常見的香辛料精油中篩選出對 C.perfringens有抑制作用的肉桂精油、艾草精油、茴香精油，通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存動力學(xué)模型，為快速進(jìn)行微生物風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料與精油

熟制雞胸肉：市售，熟制雞胸肉進(jìn)行15 min水蒸氣滅菌處理，每60 g一份，分裝備用。

肉桂精油，艾草精油，茴香精油，黑胡椒精油和姜精油：購自上海回恩國際貿(mào)易有限公司，精油濃度均為0.88 mg/mL。

1.1.2 菌種

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124：購于ATCC菌種庫；

產(chǎn)氣莢膜梭菌C1：真空脹袋的鹽焗雞中分離所得。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基

胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG），亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、吐溫-80，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 主要儀器

VORTEX-2GENIE渦旋振蕩器（美國ScientificIndustries公司）；PX-1505H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械公司）；T18 basic高速分散器（德國IKA公司）；AW200SG厭氧工作站（英國ELECTROTEK公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度的香辛料精油的配制

參考李京晶[21]方法，按表 1配置不同質(zhì)量濃度香辛料精油，均質(zhì)1 min，制得精油懸浮液。

表1 熟制雞胸肉中的香辛料精油的濃度Table 1 Concentration of spices essential oil in cooked chicken breast meat

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

參考 SN/T 1538.1-2016[22]，將 15～20 mL TSA（tryptose soya agar）和 TSC（tryptose sulfite cycloserine）培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿（90 mm）中，待培養(yǎng)基冷卻凝固，即制備好平板，待用；將FTG（fluid thioglycollate medium）液體培養(yǎng)基滅菌后，待用。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)物的制備

參考王小慧等[23]制備濃度為 108CFU/mL的C.perfringens初始菌液，稀釋至104備用。

1.2.4 細(xì)菌的計數(shù)

培養(yǎng)后雞胸肉取樣，每組2個平行，取200 μL于TSC平板進(jìn)行微生物測定（平板涂布法），每梯度做 2個平行，涂布完成，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h，對平行試驗中同一稀釋度的3個平板上C.perfringens進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3 模型構(gòu)建

用 MATLAB軟件構(gòu)建 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[24-28]進(jìn)行C.perfringens生長/殘存模型預(yù)測。

1.3.1 數(shù)據(jù)歸一化和去歸一化處理

在運(yùn)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為某目標(biāo)值的預(yù)測時，為使網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練更加準(zhǔn)確，在訓(xùn)練之前將所有輸入資料進(jìn)行歸一化處理[23]，是為了避免選擇許多與目標(biāo)值相關(guān)的輸入因子作為輸入值時所造成的巨大差異性，可以根據(jù)公式（1）將數(shù)據(jù)全部壓縮在0～1范圍內(nèi)。

式中kn為尺度化的值；k為原始資料；Amax和Amin分別為資料庫中的最大值和最小值。

本文將肉桂精油、艾草精油、茴香精油3種天然的香辛料精油的不同質(zhì)量濃度作為輸入?yún)?shù)；對應(yīng)的熟制雞胸肉中C.perfringens（C1和ATCC13124）生長/殘存數(shù)作為目標(biāo)參數(shù)；通過歸一化將資料數(shù)值變?yōu)?0到 1范圍內(nèi)。

文中選 6組試驗樣本進(jìn)行預(yù)測，并對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行返歸一化處理。

1.3.2 隱層神經(jīng)元函數(shù)的選取和算法優(yōu)化

采用的是含有一個隱含層的單輸入單輸出的雙層BP網(wǎng)絡(luò)作為預(yù)測模型。由于目前輸入輸出已確定因此網(wǎng)絡(luò)中隱含層神經(jīng)元的數(shù)目決定了實際問題的復(fù)雜程度以及對期望誤差，訓(xùn)練結(jié)果采用判定模擬值與預(yù)測值兩者之間相關(guān)性的決定系數(shù)R2、均方根誤差RMSE進(jìn)行評定。基于文獻(xiàn)中的經(jīng)驗公式[29]，文中選取得隱層神經(jīng)元個數(shù)通過試驗比較得到數(shù)目為2。

該BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)使用列文伯格-馬夸爾特演算法[30-31]，在程序中可以通過直接設(shè)定規(guī)則化性能函數(shù)及性能比來增進(jìn)網(wǎng)絡(luò)廣義化能力，且如果設(shè)定更大，則網(wǎng)絡(luò)將會花費(fèi)比提前停止法較長的時間來進(jìn)行收斂，經(jīng)過訓(xùn)練的樣本歸一化后則其網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)參數(shù)為trainlm函數(shù)，最大的訓(xùn)練次數(shù)為5 000次，訓(xùn)練步長0.1，期望誤差為1×10-7，創(chuàng)建一個單向傳播的多層前向網(wǎng)絡(luò)。

1.4 模型評價

應(yīng)用建立的不同濃度精油下熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存動力學(xué)模型求得的預(yù)測值，與測得的實際值進(jìn)行對比，采用偏差度（Af）和準(zhǔn)確度(Bf)來評價模型的可行性。

方程（2）和（3）中，N實測是試驗實際測得的C.perfringens數(shù)量，lgCFU/g；N預(yù)測是應(yīng)用 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型得到的與N實測同一濃度的 C.perfringens數(shù)量，lgCFU/g；n是試驗次數(shù)。

1.5 模型驗證

將樣本保存在一個矩陣中，從3個樣本中隨機(jī)挑取1個放入預(yù)測集，隨機(jī)訓(xùn)練集占總樣本的60.6%（120例），驗證樣本占32.5%（39例），預(yù)測樣本占32.5%（39例）。分別采用均方根誤差RMSE（公式4）和相關(guān)系數(shù)R2（公式（5））來評價模型驗證的精度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2016bMATLAB數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，所有的數(shù)據(jù)均為3個平行樣品測定3次的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建不同香辛料精油對 C.perfringens殘生長/殘存預(yù)測模型及模型驗證

2.1.1 模型構(gòu)建

香辛料精油對熟制雞胸肉中 C.perfringens具有抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)，精油濃度越大，C.perfringens的最終濃度越?。徊捎?BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行非線性擬合，繪制出肉桂精油、艾草精油精油 3種精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的預(yù)測模型曲線。

圖1為3種香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens（ATCC13124和C1）生長/殘存模擬情況，依據(jù)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合曲線斜率判斷ATCC13124和C1隨濃度下降速率：當(dāng)精油濃度≤5.5 mg/mL時，ATCC13124隨肉桂精油和茴香精油濃度增加下降的速率大于C1；在相同濃度范圍內(nèi)，ATCC13124隨艾草精油濃度增加下降的速率低于C1；當(dāng)精油濃度≥11 mg/mL時，ATCC13124隨肉桂精油和艾草精油濃度增加下降速率低于C1，尤其為肉桂精油曲線幾乎趨于平緩，不再發(fā)生變化，在相同濃度范圍內(nèi)ATCC13124隨茴香精油濃度增加下降速率高于C1；當(dāng)精油濃度≥22 mg/mL時，ATCC13124和C1隨肉桂精油濃度增加變化，趨勢趨于平緩，ATCC13124隨艾草精油濃度增加下降速率逐漸大于C1，ATCC13124隨茴香精油濃度增加下降速率逐漸減小，C1則相反。對比上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一精油，對不同C.perfringens菌株ATCC13124和C1的抑制情況不同。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens ATCC13124和C1殘存情況結(jié)果：精油濃度為5.5 mg/mL時，ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數(shù)低于 7.00 lgCFU/g而在艾草精油和茴香精油中均大于7.00 lgCFU/g；精油濃度為11 mg/mL時，ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數(shù)低于7.00 lgCFU/g而在艾草精油和茴香精油中均大于7.00 lgCFU/g；精油濃度為22 mg/mL時，ATCC13124和C1在肉桂精油中殘存數(shù)低于5.00 lgCFU/g，ATCC13124和C1在艾草精油和茴香精油中均大于5.00 lgCFU/g。因此，對比同一濃度，肉桂精油中的C.perfringens殘存數(shù)較低，抑制作用比艾草精油和茴香精油明顯。

圖1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的預(yù)測模型Fig.1 Prediction models of C.perfringens in cooked chicken breast by BP neural network fitting different essential oils

2.1.2 模型評價

由表 2可知在不同精油下準(zhǔn)確度（Af)和偏差度(Bf),預(yù)測值和實測值之間的差異Af均接近于 1，介于 10%以內(nèi)，預(yù)測值上下波動的幅度Bf的值不超過1%，因此基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立的不同香辛料精油對C.perfringens的生長/殘存動力學(xué)模型是可靠的。

表2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合不同精油對熟制雞胸肉中C.perfringens（ATCC13124、C1）菌的模型驗證指標(biāo)Table 2 BP neural network fitting model validation indicators of different essentbial oils for C.perfringens (ATCC13124, C1) in cooked chicken breast

2.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建不同香辛料精油對產(chǎn)氣夾膜梭菌殘生長/殘存預(yù)測模型驗證

通過交互驗證的方法對不同香辛料精油的濃度與C.perfringens生長/殘存數(shù)建立校正模型，然后通過獨(dú)立樣本對模型進(jìn)行魯棒性檢驗結(jié)果如圖2和表3所示：所構(gòu)建的模型的預(yù)測精度R2均大于0.917，擬合度高，其中針對ATCC13124，艾草精油的預(yù)測效果均最佳，訓(xùn)練集、預(yù)測集和驗證集R2分別為0.992、0.988、0.986，均方根誤差RMSE分別為0.197、0.197、0.200 CFU/g；對于C1，肉桂精油的預(yù)測模型效果最佳，訓(xùn)練集、預(yù)測集和驗證集 R2分別為 0.976、0.971和 0.970，均方根誤差 RMSE分別為0.271、0.272、0.279 CFU/g。

圖2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的模型驗證Fig.2 Model verification of C. perfringens in cooked chicken breast by BP neural network fitting different spices essential oils

表3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合添加精油時熟制雞胸肉中C.perfringens（ATCC13124、C1）的模型驗證評價指標(biāo)Table 3 BP neural network fitting model verification evaluation index of parameter resetting of C.perfringens (ATCC13124, C1) in cooked chicken breast meat when adding essential oil CFU·g-1

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型擬合不同香辛料精油對熟制雞胸肉中C.perfringens的生長/殘存曲線，R2均在0.922～0.992之間；對模型進(jìn)行魯棒性檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn) R2均在0.920以上，均方根誤差RMSE在0.200～0.640 CFU/g之間，預(yù)測值和實測值擬合效果較好。表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對熟制雞胸肉中C.perfringens生長/殘存情況有很好的預(yù)測效果；依據(jù)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合C.perfringens的生長/殘存生長率，同一精油，對不同 C.perfringens菌株ATCC13124和C1的抑制情況不同，顯示出差異性；對比同一濃度，發(fā)現(xiàn)肉桂精油中C.perfringens殘存數(shù)最低，抑制作用最強(qiáng)。