陳慧勤，蔡克鋒

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建 泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，泉州 362000)

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國肺心病的發(fā)病率較高，患病率達(dá)0.48%，在各種器質(zhì)性心臟病中，肺心病所占的百分比約為18%～37%[1]。慢性肺源性心臟病進(jìn)展過程中，心肌肥厚雖然在早期有一定的代償作用，但持續(xù)過久則會引起心力衰竭甚至猝死，因此治療心肌肥厚是醫(yī)學(xué)界長期以來的難題。由于以往較常采用左心室心肌肥厚大鼠模型來進(jìn)行研究，而野百合堿誘導(dǎo)的右心室心肌肥厚的模型報道很少，以往研究表明該方法誘導(dǎo)的右心室肥厚的機(jī)制與肺源性心臟病的病理生理變化過程最為接近[2]，且具有簡單、可重復(fù)性好的優(yōu)點，適用于研究肺源性心臟病病理生理學(xué)機(jī)制及相關(guān)藥物的研究。本課題組前期的研究已經(jīng)證實野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的右心室心肌肥厚與TPRC6通道的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[3]。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract,EGB)為傳統(tǒng)中藥銀杏葉，采用現(xiàn)代制藥工藝從中提其有效成分而制成的制劑如金納多、銀杏葉片等，已有研究表明EGB可多環(huán)節(jié)、多靶點地防治心腦血管疾病，有清除自由基、改善血液流變學(xué)、抗血小板聚集、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、防治動脈粥樣硬化、保護(hù)線粒體和減少組織耗能等作用[4]。本研究旨在通過建立MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室心肌肥厚EGB早期干預(yù)模型探討銀杏葉提取物對MCT誘導(dǎo)的心肌肥厚的早期保護(hù)作用，并觀察銀杏葉提取物對TRPC6的表達(dá)的影響從而探究EGB對于心肌肥厚防治作用的病理生理學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

金納多銀杏葉提取物(德國威瑪舒培博士藥廠)，野百合堿(Aladdin，上海);水合氯醛(Aladdin，上海)，TRIzol(碧云天，中國)，兔抗TRPC6抗體(Abcam，美國)，兔抗β-actin(Abcam，美國)，ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，30%丙烯酰胺(29∶1，上海生工)，甲基磺酰氟(PMSF，Sigma，美國)，過硫酸銨(Amresco，美國)，十二烷基硫酸鈉SDS(Amresco，美國)，甘氨酸(Amresco，美國)，溴酚藍(lán)(Amresco，美國)，巰基乙醇(Amresco，美國)，TEMED(Amersham Pharmacia Biotech，美國)。

1.2 模型制備及給藥方法

健康清潔級雄性SD大鼠(180～200)g 72只隨機(jī)平均分為3組：對照組(CON組)、野百合堿誘導(dǎo)右心室心肌肥厚組(MCT組)、銀杏葉提取物治療組(EGB組)。MCT組與EGB組首日均以2%MCT按60 mg/kg 劑量腹腔注射，注射后第2日開始，MCT組每日予2 ml 0.9% NaCl注射液灌胃，EGB組以60 mg/kg銀杏葉提取物灌胃,對照組SD大鼠首日一次性腹腔注射2 ml 0.9% NaCl注射液,注射后第2日起常規(guī)飼養(yǎng)3周。

1.3 血液動力學(xué)檢測

SD大鼠以氨基甲酸乙酯腹腔麻醉、固定、分離右頸外靜脈，選擇PE50管連接RM6240生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，行右心室插管法測量平均右心室收縮壓(mean right ventricular systolic pressure，mRVSP)、心率(heart rate,HR)、體循環(huán)平均充盈壓(mean systemic arterial pressure，mSAP)和右心室壓力最大上升/下降速率(right ventricular pressure maximum rate of rise/descent，RV±dp/dtmax)。

1.4 右心室重量指數(shù)測定

大鼠測定血液動力學(xué)指標(biāo)后迅速開胸取出心臟。沿房室交界處分離右心室(right ventricular，RV)及左心室+室間隔(left ventricularventricular septum，LV+S)，稱重后計算RV/(LV+S)即右心室重量指數(shù)(right ventricular mass index，RVMI)。

1.5 心肌組織病理學(xué)形態(tài)觀察

測完RVMI后剪下SD大鼠心尖部的右心室心肌組織迅速固定后脫水、石蠟包埋、HE染色，制作病理切片，并于光鏡下觀察心肌病理改變。

1.6 RT-PCR檢測TRPC6 mRNA表達(dá)水平

各組心室組織塊在液氮中充分研磨后，按照TRIzol試劑盒說明書的方法提取總RNA，后使用Takara試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行實時定量PCR，TRPC6 引物(上海生工合成)序列如下：TRPC6上游引物5＇- GACAGAAATCAGCTGGCACA -3＇，TRPC6下游引物 5＇- TCCCCTTCGTTCACTTCATC -3＇。置于 PCR 儀中按照預(yù)變性、變性、退火、延伸的過程進(jìn)行擴(kuò)增并根據(jù)測得的 Ct 值求得各樣本TRPC6的相對表達(dá)水平。

1.7 Western blot 檢測心肌組織TRPC6 的蛋白表達(dá)

各組大鼠心肌組織提取蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，制備凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗(兔抗β-ACTIN 1∶1 000;兔抗 TRPC6 1∶500)，置于搖床4℃孵育過夜，后加二抗(羊抗兔1∶1 000)室溫孵育1 h。將膜放于化學(xué)發(fā)光成像儀中，加ECL 發(fā)光液，顯影，成像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較

MCT組及EGB組的平均體循環(huán)動脈壓及心率，無顯著差異，MCT組的RVSP顯著升高，右心室內(nèi)壓力最大上升速率(right ventricular pressure maximum rate of rise，RV+dp/dtmax)顯著增加，右心室內(nèi)壓力最大下降速率(right ventricular pressure maximum rate of descent，RV-dp/dtmax)顯著下降(P<0.01,表1)；而EGB早期干預(yù)組雖然與MCT組的各項指標(biāo)有相同趨勢的變化，但是EGB組各項指標(biāo)變化的幅度均顯著降低(P<0.01,表1)。

CON：Control;MCT:Monocrotaline-induced right ventricular hypertrophy group;EGb：Ginkgo biloba extract treated group;RVSP:Right ventricular systolic pressure;mSAP：Mean systemic arterial pressure;HR：Heart rate;RV+dp/dtmax：Right ventricular pressure maximum rate of rise;RV-dp/dtmax：Right ventricular pressure maximum rate of descent
**P<0.01vsCON group

2.2 各組心臟重量指數(shù)比較

CON組RVMI為(28.32±1.31)%，與CON組相比，MCT組RVMI顯著升高至(47.99±3.83)%(P<0.01)，EGB組RVMI也顯著升高至(34.49± 1.49)%，但較MCT組顯著降低(P<0.01)。

2.3 各組病理形態(tài)學(xué)結(jié)果比較

HE染色可見CON組大鼠右心室心肌細(xì)胞胞核清晰，心肌纖維邊緣整齊，排列有序。(圖1A)。MCT組右心室心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維粗大，細(xì)胞核深染，形狀不整(圖1B)。EGB組右心室心肌細(xì)胞較MCT組有顯著改善(圖1C，圖1)。

2.4 右心室心肌組織TRPC6 mRNA相對表達(dá)水平比較

實時定量RT-PCR結(jié)果顯示，與CON組相比，MCT組TRPC6 mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,n=24),而EGB組TRPC6 mRNA相對表達(dá)水平較CON組顯著升高，但是較MCT組顯著降低(P<0.01,n=24，表2)。

2.5 右心室心肌組織TRPC6蛋白表達(dá)水平比較

Western blot免疫印記法以β-actin為內(nèi)參對大鼠右心室心肌組織上 TRPC6 通道蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析,與CON組相比，SD大鼠右心室TRPC6蛋白相對表達(dá)水平在MCT組顯著升高(P<0.05,n=4)，而 EGB組TRPC6蛋白相對表達(dá)水平較MCT組則顯著降低(P<0.05,n=4，圖2，表2)。

Fig.2TRPC6 protein expression in right ventricular of each group

A:CON group;B:MCT group;C:EGB group

Tab. 2 The mRNA and protein expression level of

*P<0.05，**P<0.01vsCON group

3 討論

本實驗結(jié)果通過血流動力學(xué)變化可以觀察到MCT給藥三周使得大鼠RVSP及RV±dp/dtmax顯著升高，提示大鼠右心室的收縮、舒張功能代償性增強(qiáng)；RVMI顯示大鼠右心室重量指數(shù)顯著升高；且右心室心肌組織切片HE染色可見右心室心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維粗大，細(xì)胞核深染，以上結(jié)果顯示大鼠右心室心肌肥厚模型成功建立。心肌肥厚是多種心臟疾病共同的病理過程，發(fā)病初期表現(xiàn)為代償性心肌纖維增粗，心肌收縮舒張功能增加，但是長期將引起失代償、心衰甚至死亡。在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中，鈣離子內(nèi)流在心肌肥厚中是引發(fā)心肌肥厚和凋亡的重要原因之一[5]，以往的研究已經(jīng)證實TRPC亞家族(canonical transient receptor potential,TRPC)與ROCC、SACC和SOCC三種Ca2+通道有關(guān)，而在ROCC通道中，TRPC6是其主要的分子基礎(chǔ)[6]。PLC被藥物等外界刺激激活后可進(jìn)一步分解為三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)，后者能激活ROCC，并調(diào)控ROCC介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，從而引起下游的鈣調(diào)磷酸酶/NFAT信號通路激活介導(dǎo)心肌肥厚[7]。有研究已經(jīng)證明 TRPC介導(dǎo)的 Ca2+-NFAT信號通路的激活可以誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生[8]，且新生期大鼠的心肌細(xì)胞中敲除 TRPC6能夠抑制 NFAT 的激活和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚[9]，證明TRPC6與心肌肥厚的發(fā)生有關(guān)。

近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EGB可通過清除自由基與抗氧化、改善血液流變學(xué)和抗血小板聚集、急性冠脈綜合征患者的炎癥因子水平、減輕動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血脂、防治動脈粥樣硬化、保護(hù)線粒體和減少組織耗能以上相關(guān)機(jī)制起到預(yù)防心肌肥厚的作用，且已證明EGB在治療冠心病、心力衰竭、心律失常等方面的顯著療效[10-12]，但鮮有文章報導(dǎo)其在治療心肌肥厚方面是否也有作用。因此，本課題組初探EGB對心肌肥厚是否有治療作用，并在此基礎(chǔ)上探索其可能的機(jī)制。

本實驗結(jié)果從血流動力學(xué)變化、心臟重量指數(shù)方面證實造模初期用EGB預(yù)處理可明顯改善心肌肥厚血流動力學(xué)的相關(guān)指標(biāo)，又通過HE染色觀察到其對心肌病理形態(tài)學(xué)也有顯著改善，可初步判斷EGB預(yù)處理可預(yù)防心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。在分子生物學(xué)機(jī)制探索中，RT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，EGB組較MCT組大鼠心肌組織TRPC6的基因及蛋白的表達(dá)含量顯著降低，據(jù)此推論，EGB預(yù)防心肌肥厚可能是通過降低TRPC6的含量后使ROCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流減少，并進(jìn)而抑制鈣調(diào)抑制磷酸酶/NFAT信號通路,故EGB對心肌肥厚的預(yù)防作用可能與下調(diào)TRPC6有關(guān)。