孔令宇，席 鏨，馬文婷，楊飛云，牛麗丹，石金河△

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒外科，河南 衛(wèi)輝 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

Notch基因是1917年Morgan及其同事在果蠅中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高度保守的基因家族，編碼四個(gè)跨膜受體，即Notch，Notch2，Notch3和Notch4，參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化以及器官的發(fā)育等[1,2]。近年來的研究顯示，Notch信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)的發(fā)生，發(fā)展，生理及病理過程中均發(fā)揮著重要作用。但是，Notch信號(hào)通路參與心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制并不十分明確。低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)可通過調(diào)節(jié)多種因子而參與對(duì)心臟的保護(hù)作用[3]，在對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用中，Notch信號(hào)通路與HIF-1之間是否有關(guān)聯(lián)還不得而知。本研究以H9C2細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)缺氧缺糖模型中，Notch信號(hào)通路與HIF-1α及自噬之間的關(guān)系，將為臨床心肌細(xì)胞缺血缺氧的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞H9C2 細(xì)胞株購自于協(xié)和細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自于美國Sigma公司，Notch1 siRNA,HIF-1α siRNA及陰性對(duì)照(Negative control，NC)siRNA購自于SANTA Cruz公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自于美國Invitrogen公司。Notch1抗體，HIF-1α抗體購自于SANTA Cruz公司，LC3I抗體,LC3II抗體購自于abcam公司，GAPDH抗體，β-actin抗體購自于Sigma公司，熒光II抗購自于LI-COR公司。

1.3 H9C2的培養(yǎng)

H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中(含100 U/ml 青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素)，置于37℃、5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.4 缺氧缺糖細(xì)胞模型的建立

將H9C2細(xì)胞正常培養(yǎng)(37℃、5 % CO2的恒溫培養(yǎng))24 h后，更換成不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基低氧條件下(1%O2、95% N2、5% CO2)培養(yǎng)24 h。

1.5 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的使用說明，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將Notch1 siRNA,HIF-1α siRNA與NC siRNA轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞。

1.6 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組

正常對(duì)照組，缺氧缺糖組(OGD group)，缺氧缺糖+ NC siRNA組(轉(zhuǎn)染NC siRNA后缺氧缺糖條件培養(yǎng)24 h)，缺氧缺糖+ Notch1 siRNA組(轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA后缺氧缺糖條件培養(yǎng)24 h)，缺氧缺糖+ HIF-1α siRNA組(轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA后缺氧缺糖條件培養(yǎng)24 h)。

1.7 心肌細(xì)胞活性的檢測(cè)

將H9C2按照5×103cells/well的密度接種于96孔板中，按照上述方法將細(xì)胞分為5組，在缺氧缺糖誘導(dǎo)24 h后檢測(cè)各組活性，每孔加入10 μl CCK-8溶液，正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育2～4 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD(A)值。

1.8 Western blot

收集上述5組細(xì)胞,利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Notch1抗體(1∶500)，HIF-1α抗體(1∶1 000)，Beclin1抗體(1∶500)，LC3I抗體(1∶500)，LC3II(1∶500)及β-actin抗體(1∶ 5 000),GAPDH抗體(1∶10 000)4℃孵育過夜，熒光II抗(1∶1 000)室溫孵育2 h后，Odyssey曝光，Image J軟件分析灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Notch1 siRNA與HIF-1α siRNA對(duì)Notch1及HIF-1α表達(dá)的影響

為了檢測(cè)OGD模型中Notch1 siRNA與HIF-1α siRNA的干擾效果，本文利用Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA，HIF-1α siRNA 24 h后模型中H9C2細(xì)胞中Notch1，HIF-1α的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組(NC siRNA group)相比較，轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA 24 h后，H9C2心肌細(xì)胞中Notch1的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，同時(shí)HIF-1α的表達(dá)顯著降低(P<0.05，圖1，表1)；轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA 24 h后，H9C2細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)也顯著降低(P<0.01,圖2)，而陰性對(duì)照組與模型對(duì)照組相比并無明顯差別。結(jié)果提示，Notch1 siRNA與HIF-1α siRNA均具有較好的干擾效果，抑制 H9C2細(xì)胞中Notch1的激活可進(jìn)一步抑制HIF-1α的產(chǎn)生。

Fig.1Effects of Notch1 siRNA on the expressions of Notch1 and HIF-1α detected by Western blot
1:Normal group;2:NC group;3:Notch1 siRNA group;HIF-1α:Hypoxic induction factor-1α

Tab. 1 Effects of Notch1 siRNA on the expressions of Notch1 and HIF-1α detected by Western blot

*P<0.05，**P<0.01vsNC group

Fig.2Western blot test was used to detect the interference effect of HIF-1α siRNA
1:Normal group;2:Negative control(NC)group;3:HIF-1α siRNA group
**P<0.01vsNC group

2.2 各組心肌細(xì)胞活性

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，與正常對(duì)照組相比較，缺氧缺糖組細(xì)胞的活性顯著降低(P<0.01)；而與缺氧缺糖組相比較，轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA及HIF-1α siRNA后，兩組細(xì)胞的活性進(jìn)一步降低(P<0.01,P<0.01)。如圖1所示，抑制H9C2細(xì)胞中Notch1的激活可進(jìn)一步抑制HIF-1α的產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA與HIF-1α siRNA的兩組細(xì)胞的活性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并沒有明顯的差別(P>0.05)，這就提示在缺氧缺糖情況下，Notch1信號(hào)的激活可促進(jìn)對(duì)模型細(xì)胞中HIF-1α的產(chǎn)生，從而對(duì)模型細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

2.3 各組細(xì)胞中Beclin1，LC3I，LC3II 蛋白的表達(dá)變化

結(jié)果如圖3所示，與正常對(duì)照組相比較，缺氧缺糖組細(xì)胞中Beclin1，LC3I，LC3II蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；而與缺氧缺糖組相比較，轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA后，細(xì)胞中Beclin1mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，LC3I與LC3II 蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.01，P<0.01)，LC3II/LC3I的比率顯著降低；轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA后，細(xì)胞中Beclin1蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，LC3I與LC3II蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.01，P<0.01)，LC3II/LC3I的比率顯著降低，而轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA與HIF-1α siRNA的兩組細(xì)胞相比較Beclin1，LC3I與LC3II蛋白的表達(dá)變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并沒有明顯的差別，這些結(jié)果提示Notch1通過促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)一步通過增強(qiáng)自噬對(duì)缺氧缺糖的心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，抑制Notch1可抑制HIF-1α的產(chǎn)生進(jìn)一步干擾自噬途徑，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞損傷。

Tab. 2 Activity of cells in each group was detected by CCK-8 assay

1:Normal group;2:OGD group;3:OGD group+NC siRNA group;4:OGD group+Notch1 siRNA group;5:OGD group+HIF-1α siRNA group;OGD:Oxygen-glucose deprivation
**P<0.01vsOGD group

Fig.3The expressions of Beclin1,LC3 I and LC3 II protein were detected by Western blot in each group
1:Normal group;2:OGD group;3:OGD group+NC siRNA group;4:OGD group+Notch1 siRNA group;5:OGD group+HIF-1α siRNA group

3 討論

本文首次研究了Notch信號(hào)通路的激活與HIF-1α的產(chǎn)生及心肌細(xì)胞自噬之間的關(guān)聯(lián)，缺氧缺糖條件下抑制Notch信號(hào)中Notch1的表達(dá)，可抑制HIF-1α的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制缺氧缺糖心肌細(xì)胞的自噬，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞損傷，因而，Notch1通過促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，增強(qiáng)自噬，對(duì)缺氧缺糖的心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

心肌梗死是當(dāng)前臨床上常見的缺血性心臟病的主要類型之一[4]，嚴(yán)重威脅著人們生命。近年來，Notch信號(hào)通路在心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用越來越受到研究者們的注意。丹參酮ⅡA可通過抑制Notch信號(hào)通路的活化及調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡而在乳鼠心肌細(xì)胞I/R損傷中起到保護(hù)作用[5]。Notch 信號(hào)途徑對(duì)心肌細(xì)胞具有的保護(hù)作用可能與抑制ROS的水平有關(guān)[6]。Notch3/Akt信號(hào)通路可增強(qiáng)抑瘤素M對(duì)缺血/再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[7]，Notch1信號(hào)可對(duì)燒傷引起的心肌細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用[8]。Notch1參與調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[9]。microRNA-99a通過激活H9C2心肌細(xì)胞中的Notch通路來降低脂多糖對(duì)心肌細(xì)胞的氧化損傷[10]。

HIF-1是急性心肌梗死后心臟適應(yīng)性變化過程中的主要調(diào)節(jié)因子之一，其可通過調(diào)節(jié)多種因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等，從而參與對(duì)心臟的保護(hù)作用[3,11]。Przyklenk K等人的研究結(jié)果顯示，心肌缺血缺氧時(shí)，可通過誘發(fā)自噬而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[12]，而自噬抑制劑抑制自噬后導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞凋亡增加,且HIF-1參與缺氧誘導(dǎo)的自噬抵抗凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用[13]。然而，在缺氧缺糖條件下，Notch信號(hào)通路的激活與HIF-1α的產(chǎn)生及心肌細(xì)胞自噬之間是否存在關(guān)聯(lián)，還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果顯示，利用OGD模型，轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA,Notch1 siRNA至心肌細(xì)胞后，HIF-1α siRNA可有效敲低模型心肌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，而Notch1 siRNA可有效敲低模型心肌細(xì)胞中Notch1與HIF-1α的表達(dá)；與OGD組細(xì)胞相比較 Notch1 siRNA與HIF-1α siRNA可進(jìn)一步降低OGD模型中心肌細(xì)胞的活性，且二者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Beclin1及LC3II/LC3I的比率與自噬密切相關(guān)，當(dāng)自噬途徑被損壞后，Beclin1的表達(dá)降低，同時(shí)LC3II/LC3I的比率也降低[14]，進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)Notch1 siRNA與HIF-1α siRNA可降低模型細(xì)胞中自噬相關(guān)的基因Beclin1，LC3I，LC3II的表達(dá)，降低LC3II/LC3I的比率。

綜上所述，Notch1信號(hào)的激活可促進(jìn)HIF-1α的產(chǎn)生，HIF-1α可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，抑制Notch1的表達(dá)后，可減少自噬途徑，進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞的損傷，Notch1通過調(diào)節(jié)模型細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)促進(jìn)缺氧缺糖誘導(dǎo)的自噬而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究探討了Notch信號(hào)通路與HIF-1α及自噬之間的關(guān)系，將為臨床心肌細(xì)胞缺血缺氧的治療提供參考。