楊張良，童海玲，孫夢(mèng)蝶，袁 杰，胡 鶯，王旭燾，齊敏友

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥理研究所，杭州 310014)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)可引起多系統(tǒng)損害，導(dǎo)致心臟、腎、眼、神經(jīng)和血管等組織器官的慢性進(jìn)行性病變，功能減退及衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，對(duì)其病因病理及治療亟待研究,故建立合適的糖尿病模型至關(guān)重要[1-3]。2型糖尿病動(dòng)物模型可以分為自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因糖尿病動(dòng)物模型和藥物誘導(dǎo)致糖尿病動(dòng)物模型。自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型有KK-Ay小鼠、ob/ob小鼠和db/db小鼠等類(lèi)型；轉(zhuǎn)基因型動(dòng)物模型有MKR小鼠、MC4R-KO模型等種類(lèi)[4-7]。第三類(lèi)為通過(guò)藥物誘導(dǎo)致糖尿病動(dòng)物模型的方法。由于其成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用。

目前較多的文獻(xiàn)都聚焦于如何獲得或者制備糖尿病動(dòng)物模型，而對(duì)糖尿病動(dòng)物模型病理和生化等指標(biāo)隨時(shí)間變化的規(guī)律的報(bào)導(dǎo)較少，尤其是對(duì)組織和器官等出現(xiàn)明顯適合研究的病變時(shí)間點(diǎn)報(bào)導(dǎo)較為模糊?；诖耍緦?shí)驗(yàn)通過(guò)建立高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠動(dòng)物模型，檢測(cè)和分析造模后不同時(shí)期2型糖尿病小鼠血生化指標(biāo)及心和腎組織病理變化情況，觀察2型糖尿病小鼠心和腎疾病的病變過(guò)程，判斷組織器官發(fā)生病理和生化改變的時(shí)間，為2型糖尿病模型小鼠選擇造模最佳時(shí)間提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

鏈脲佐菌素(HPLC≥98%，美國(guó)Sigma公司)；強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀、血糖試紙(Onetouch ultraeasy，美國(guó)Johnson公司)；超低溫冰箱(702，美國(guó)Thermo公司)；電子天平(AL104，瑞士Mettler Toledo公司)；超純水儀(PURELAB Classical，英國(guó)ELGA)；大容量高速冷凍離心機(jī)(Z36HK，德國(guó)Hermle公司)；恒溫水浴箱(WB22LA，德國(guó)Memmert公司)；倒置熒光顯微鏡(TI-S，日本Nikon公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和模型建立

雄性ICR小鼠40只，SPF級(jí)，體重(20±2)g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(浙)2017-0001。32只小鼠高脂飼料(常規(guī)飼料78.5%，豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，膽鹽0.5%)，喂養(yǎng)8周后連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)，制備2型糖尿病模型小鼠。9 d后，禁食12 h后，通過(guò)尾部取血，測(cè)量空腹血糖，若空腹血糖值>11.1 mmol/L，即可判定為小鼠造模成功[8]。將造模成功的小鼠隨機(jī)分成3組：造模4周、6周、8周組。分別于成模后第4、6、8周處死一組小鼠。另各取8只雄性ICR小鼠作為對(duì)照組，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，與糖尿病組小鼠同時(shí)處死。

1.3 一般指標(biāo)檢測(cè)

小鼠隔夜禁食不禁水，次日稱(chēng)體重并測(cè)定空腹血糖。

1.4 樣本收集及臟器系數(shù)計(jì)算

血樣本留?。盒∈笳矍蛉⊙仂o置6 h，取上清，-20℃冰箱保存待用。臟器系數(shù)測(cè)定：取血后立即處死小鼠，迅速取出心臟，擠出心腔血液，剪心耳及心包膜，生理鹽水洗凈稱(chēng)取全心重；剪心房及右心室，稱(chēng)取左室重；取出小鼠兩側(cè)腎臟去除腎包膜后用生理鹽水洗凈擦干后稱(chēng)重。計(jì)算公式如下：心臟臟器系數(shù) = 心臟質(zhì)量(g)/體重(g)×100%，腎臟臟器系數(shù)=腎臟質(zhì)量(g)/體重(g)×100%。組織樣本留?。焊鹘M小鼠處死后分別取小鼠心臟和腎臟組織，放入4%多聚甲醛溶液中24 h。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酐(creatinine,CR)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的含量。

1.6 病理學(xué)檢測(cè)

心肌組織：心肌組織固定72 h后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，進(jìn)行HE染色、Masson染色，400倍光鏡下觀察。腎臟組織：腎臟組織固定72 h后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，進(jìn)行HE染色、PAS染色，400倍光鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠造模情況

造模前各組小鼠之間血糖和體重不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，注射STZ造模成功后各組小鼠之間血糖和體重同樣不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。說(shuō)明分組后各組小鼠狀態(tài)一致，對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不存在影響。注射STZ后，小鼠的血糖值超過(guò)11.1 mmol/L的閾值，表明造模成功[8]。

Tab. 1 Blood glucose and weight levels in four groups of mice n =8)

**P<0.01vscontrol group

2.2 糖尿病小鼠一般特征及臟器系數(shù)隨時(shí)間變化的改變

與對(duì)照組相比，除了第4周組的體重和心臟臟器系數(shù)未呈現(xiàn)顯著性差異，其他指標(biāo)均呈顯著性差異(P<0.05，表2)。而且成模后小鼠體重隨時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸下降；成模后心臟臟器系數(shù)和腎臟臟器系數(shù)則隨時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸增大，且第8周組小鼠心臟臟器系數(shù)與第4周組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表2)。說(shuō)明隨患病時(shí)間增加，小鼠體重會(huì)隨之降低，而心臟和腎臟會(huì)逐漸肥大。

2.3 糖尿病小鼠心肌功能和腎功能隨時(shí)間變化的改變

在造模成功后，隨時(shí)間增長(zhǎng)，CK、LDH、Cr和BUN都有增長(zhǎng)的趨勢(shì)。第8周組小鼠CK、LDH、Cr和BUN均顯著大于第4周組小鼠(P<0.01，表3)，且CK、LDH和BUN顯著大于第6周組小鼠(P<0.05，表3)。與對(duì)照組相比較，第4周組小鼠除了Cr外，其余均未呈現(xiàn)出顯著性差異；第6周組小鼠各指標(biāo)均與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05，表3)，第8周組小鼠各指標(biāo)也與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異(P<0.01，表3)。

2.4 糖尿病小鼠各組織病理學(xué)觀察

心肌采用HE染色和Masson染色。HE染色(圖1)可以觀察心肌病變的整體情況，Masson染色(圖2)側(cè)重觀察小鼠心肌纖維化情況。由圖1和圖2可知，對(duì)照組組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊、緊致，細(xì)胞間及血管周?chē)乃{(lán)色纖維物質(zhì)肉眼難以察覺(jué)。成模后第4周組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間空隙小，但細(xì)胞間以及血管周?chē)嬗猩倭克{(lán)色的纖維物質(zhì)。第6周組的小鼠心肌細(xì)胞排列松散、紊亂，細(xì)胞之間有較大的空隙，心肌細(xì)胞肥大、腫脹，通過(guò)Masson染色可見(jiàn)細(xì)胞間以及血管周?chē)霈F(xiàn)明顯的藍(lán)色呈堆積狀分布的纖維物質(zhì)，這些纖維物質(zhì)大都分布雜亂。心肌組織已經(jīng)出現(xiàn)明顯炎癥現(xiàn)象。第8周組小鼠的心肌組織病理情況持續(xù)惡化，細(xì)胞間幾乎都出現(xiàn)了空隙，心肌細(xì)胞肥大甚至破裂，切片中的藍(lán)色纖維物質(zhì)幾乎呈網(wǎng)狀與心肌細(xì)胞交織在一起。心臟的炎癥情況加重，一些細(xì)胞甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

腎臟組織采用HE染色和PAS染色；其中HE染色觀察整體情況；PAS染色可以觀察腎小球系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞增生。圖2中對(duì)照組小鼠的腎小球結(jié)構(gòu)外形正常，邊界清晰，基底膜未出現(xiàn)增厚現(xiàn)象。第4周組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)較為清晰，腎小球基底膜稍有增厚，毛細(xì)血管襻開(kāi)放較好，系膜區(qū)輕度增生，腎小管未出現(xiàn)萎縮。第6周組小鼠腎小球輕度肥大，腎小球基底膜增厚，出現(xiàn)“雙軌”現(xiàn)象，毛細(xì)血管襻狹窄、部分閉塞，系膜區(qū)輕度增生，腎小管萎縮。第8周組組腎小球嚴(yán)重肥大，大量毛細(xì)血管襻堵塞，系膜區(qū)增生嚴(yán)重，腎小管基底膜增厚，腎小管管腔萎縮，腎間質(zhì)可見(jiàn)部分炎性細(xì)胞存在。

Fig.1Morphological changes of the myocardial tissues in the mice(HE ×400)
A:Control group,8thweek;B:4thweek;C:6thweek;D:8thweek

Tab. 2 Effects of diabetes mellitus on cardiac organ index and renal organ index n = 8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vs4thgroup

Tab. 3 The serum levels of CK,LDH,Cr and BUN in four groups of mice(mmol/L, n = 8)

CK:Creatine kinase;LDH:Lactate dehydrogenase;Cr:Creatinine;BUN:Urea nitrogen
*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vs4thgroup;△P<0.05,△△P<0.01vs6thgroup

Fig.2Morphological changes of the myocardial tissues in the mice(Masson ×400)
A:Control group,8thweek;B:4thweek;C:6thweek;D:8thweek

Fig.3Morphological changes of the renal tissues in the mice(HE ×400)
A:Control group,8thweek;B:4thweek;C:6thweek;D:8thweek

Fig.4Morphological changes of the renal tissues in the mice(PAS ×400)
A:Control group,8thweek;B:4thweek;C:6thweek;D:8thweek

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食結(jié)合STZ制備2型糖尿病小鼠模型。小鼠空腹血糖>11.1 mmol/L，伴隨出現(xiàn)“三多一少”的現(xiàn)象，即說(shuō)明糖尿病小鼠模型造模成功。在成模后，第4周、6周、8周各處死一組小鼠，進(jìn)行病理生化方面的觀察與檢測(cè)。

糖尿病心肌病是一種由糖尿病引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變的疾病[9]。糖尿病全身系統(tǒng)性的變化如高血糖將會(huì)引起糖尿病患者心肌的病變[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，分別將四組小鼠處死后，采用HE和Masson染色，觀察心肌組織病變情況。與對(duì)照組對(duì)比可見(jiàn)，第4周組情況尚好。第6周組則出現(xiàn)較為明顯的異常，細(xì)胞排列松散，且細(xì)胞間分布纖維化組織，而第8周組則情況繼續(xù)加重。在生化指標(biāo)方面，選擇測(cè)定了與心肌損傷相關(guān)的肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)。CK和LDH廣泛分布于心肌中；當(dāng)心肌組織細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，CK和LDH會(huì)進(jìn)入血液中，故可以作為心肌受損的定量指標(biāo)[11]。與對(duì)照組相比，三組數(shù)值依次增大，且從第6周組開(kāi)始，CK和LDH與對(duì)照組存在顯著性差異。說(shuō)明患糖尿病的小鼠，隨患病時(shí)間增加，心肌損傷越嚴(yán)重。

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一。糖尿病腎病在病理組織學(xué)上的典型表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張或腎小球硬化等病變，且隨著疾病的發(fā)展損傷更加明顯[3]。對(duì)照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰無(wú)異樣。第4周組腎小球總體情況良好，而第6周組小鼠的腎小球則出現(xiàn)較為明顯的病變，第8周組小鼠的腎小球情況則繼續(xù)惡化。生化檢測(cè)選用血清肌酐(creatina,Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)，其濃度大小決定于氮類(lèi)物質(zhì)的分解和腎臟的排泄功能，故其濃度可以反映腎小球的濾過(guò)功能[12]。Cr與BUN的變化情況大致上也與CK和LDH類(lèi)似，說(shuō)明患糖尿病的小鼠隨患病時(shí)間增加腎小球的濾過(guò)作用降低，腎功能下降。

綜上所述，在成模后，比較成模后第4周、6周和8周的糖尿病小鼠的病理觀測(cè)和生化檢測(cè)情況，從第4周開(kāi)始，生化指標(biāo)和臟器系數(shù)并未全部與正常小鼠呈現(xiàn)出顯著差異；且病理切片也顯示心肌和腎小球的病變?nèi)暂^為輕微。而到第6周時(shí)，生化指標(biāo)繼續(xù)與正常組小鼠擴(kuò)大差異；從病理切片可見(jiàn)心肌組織和腎臟開(kāi)始出現(xiàn)明顯的病變。第8周時(shí)，臟器系數(shù)和生化指標(biāo)均與正常組小鼠出現(xiàn)極顯著差別；病理切片顯示病變極為明顯，小鼠各項(xiàng)情況均為最差，但考慮到實(shí)驗(yàn)耗時(shí)、成本和老鼠病死等問(wèn)題，所以若選擇第8周為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模后進(jìn)行藥物干預(yù)的時(shí)間點(diǎn)，可能已進(jìn)入病變晚期，難以達(dá)到治療效果。而選擇第4周作為藥物干預(yù)的時(shí)間，也存在器官和組織病變情況未達(dá)到穩(wěn)定時(shí)期不易觀察的問(wèn)題。所以選擇成模后第6周病變處理中期，作為糖尿病小鼠造模后進(jìn)行藥物干預(yù)等操作的時(shí)間點(diǎn)最為合適。