李文杰，楊煥民,連 帥，徐 彬，王立鵬，臧樹成，袁建彬，丁夢圓

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163000)

行為學是研究動物個體及群體為了適應內(nèi)外環(huán)境刺激所作出的反應的學科。由于行為學研究的是動物的行為，因此，它也被稱為“動物行為學”[1]。高架十字迷宮(the elevated plus maze，EPM)和曠場試驗(open field test，OFT)是研究動物行為最廣泛的實驗方法，也是評價動物焦慮行為的一種常用的手段。從1950年代到70年代，曠場實驗(OFT)已被用于檢測嚙齒動物由產(chǎn)前應激引起的潛在焦慮行為、自發(fā)活動和探索行為，能很好的判斷動物個體在受到應激以后，其認知和行為的變化等[2,3]。EPM通過比較開放臂和閉合臂的滯留時間和運動距離來判斷機體是否存在焦慮行為[4]，但OFT在行為學中通常作為對照，根據(jù)動物的趨避性結(jié)果來進行高架十字迷宮實驗，它的結(jié)果與EPM一致，兩者可以相互印證[5]。EPM實驗在應激中也有廣泛的應用，如應激對生殖、衰老、妊娠的影響等[6]，慢性不可預知應激如束縛應激中應用[7]，還有助于建立動物焦慮模型。產(chǎn)前冷應激也是慢性應激的一種，它不僅影響妊娠母鼠自身健康，對其子代也有一定的影響[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前應激可改變子代記憶、影響學習能力、使子代產(chǎn)生焦慮或抑郁狀態(tài)等[9]。在本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前冷應激可導致子代海馬中糖皮質(zhì)激素受體、鹽皮質(zhì)激素受體、羥基類固醇脫氫酶升高，海馬是大腦中與認知功能有關(guān)的重要區(qū)域之一，所以本實驗通過對妊娠母體進行冷應激，待產(chǎn)下子代后，研究產(chǎn)前母體冷應激對子代自發(fā)、探索行為及焦慮行為的影響，為進一步研究母體產(chǎn)前冷應激其子代生長發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及器材

SPF級Wister母鼠6只，體重210～250 g，購自齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物中心，在室溫(22±2)℃、相對濕度45%環(huán)境中自由飼養(yǎng)，12 h晝夜交替(開燈時間為早上8:00-晚上20:00)。曠場實驗器材(OFT-100)、高架十字迷宮實驗器材(EPM-100)。動物實驗根據(jù)黑龍江八一農(nóng)墾大學實驗動物倫理/管理委員會批準，并根據(jù)黑龍江八一農(nóng)墾大學相關(guān)指導方針進行所有實驗。

1.2 實驗設計

將6只母鼠采用陰道涂片法篩選出處于發(fā)情期的母鼠，以雌雄2∶1進行合籠交配，母鼠陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子即作為受孕標志，記為孕期第0日。將妊娠母鼠隨機分為常溫對照組(RT)和冷應激組(CT)，妊娠母鼠單籠飼養(yǎng)，于產(chǎn)前7 d將冷應激組妊娠母鼠置于4℃的飼養(yǎng)環(huán)境，進行冷刺激。常溫對照組除飼養(yǎng)溫度始終保持在22℃外，其他飼養(yǎng)條件均相同。母鼠分娩后，在常溫下進行飼養(yǎng)，待子代斷奶以后，按母鼠分組將其分為常溫對照組公鼠(22只，MR)、常溫對照組母鼠(15只，F(xiàn)R)、冷應激組公鼠(15只，MC)、冷應激組母鼠(15只，F(xiàn)C)四組，子代在產(chǎn)后四周齡時進行曠場實驗、高架十字迷宮實驗。

1.3 曠場實驗(OFT-100)

在進行曠場實驗時，子代大鼠應提前適應實驗環(huán)境，然后使用TM-Vision行為科學實驗系統(tǒng)(中國成都泰盟軟件有限公司)進行OFT-100程序。OFT-100實驗系統(tǒng)設備由不透明塑料容器(625 mm×740 mm×510 mm)和計算機控制的攝像機組成。將每只大鼠分別放置在曠場的中心，記錄525 mm×525 mm×415 mm的動物試驗區(qū)域內(nèi)的大鼠運動活動5 min。統(tǒng)計處理靜止時間、運動時間和距離。在下一組實驗開始之前用10%乙醇徹底清潔墻壁和地板表面，以消除由先前大鼠留下的氣味可能引起的偏差。評價大鼠活躍程度的指標為運動總路程和平均速度。

1.4 高架十字迷宮實驗(EPM-100)

使用TM-Vision行為科學實驗系統(tǒng)(中國成都泰盟軟件有限公司)評估大鼠焦慮樣行為，開始EPM-100程序。不透明塑料EPM-100實驗系統(tǒng)裝置由兩個相對的開放臂(30 cm×6 cm)和兩個相對的閉合臂(30 cm×6 cm×15 cm)組成，通過開放的中心平臺(6 cm×6 cm)，距離地面高100 cm。高架迷宮裝置通過控制底盤連接到PC軟件，每只子代大鼠輕輕地放在平臺的中心，運動5 min，當大鼠的四只抓在任何臂上時，該裝置記錄有效的進入次數(shù)。在5 min的測試期間，自動監(jiān)控系統(tǒng)記錄了閉合臂和開放臂中的進入次數(shù)、滯留時間和運動距離。在下一組實驗開始之前用10%乙醇徹底清潔墻壁和地板表面，以消除由先前大鼠留下的氣味可能引起的偏差。評價大鼠焦慮行為的指標為開臂進入次數(shù)、開臂滯留時間及路程。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 曠場實驗

2.1.1 總體活動 由表1可知，常溫對照組公鼠與冷應激組公鼠的總路程、平均速度、靜止時間、運動時間之間無顯著差異(P>0.05)，常溫對照組母鼠與冷應激組母鼠的總路程、平均速度、靜止時間、運動時間之間無顯著差異(P>0.05)。

2.1.2 周邊區(qū)活動 由表2可知，常溫對照組公鼠與冷應激組公鼠的四邊活動時間和四角活動時間之間無顯著差異(P>0.05)，常溫對照組母鼠與冷應激組母鼠的四邊活動和四角活動時間之間無顯著差異(P>0.05)。

2.1.3 中央?yún)^(qū)活動 由表3可知，常溫對照組公鼠與冷應激組公鼠中央?yún)^(qū)活動時間和周邊活動之間無顯著差異(P>0.05)，常溫對照組母鼠和冷應激組母鼠中央?yún)^(qū)活動時間和周邊活動之間無顯著差異(P>0.05)。

Tab. 1 Open field test of rats in different

MR:Normal temperature control group of male rats;FR:Normal temperature control group female;MC:Cold stress group of male rats;FC:Cold stress group of female rats

Tab. 2 The activities of the peripheral areas of the rats in each group in the open field test(s,

MR:Normal temperature control group of male rats;FR:Normal temperature control group female;MC:Cold stress group of male rats;FC:Cold stress group of female rats

Tab. 3 Activity of peripheral regions in each group of rats in open field test(s,

MR:Normal temperature control group of male rats;FR:Normal temperature control group female;MC:Cold stress group of male rats;FC:Cold stress group of female rats

2.2 高架十字迷宮

2.2.1 總體活動 由圖1可知，冷應激組公鼠進臂總次數(shù)高于常溫對照組公鼠進臂總次數(shù)(P<0.05)，常溫對照組母鼠和冷應激組母鼠進臂總次數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

Fig.1The elevated plus maze of total number of arm entries
*P<0.05vscontrol

2.2.2 中央平臺活動 冷應激組公鼠中央平臺區(qū)路程顯著高于常溫對照組公鼠中央平臺區(qū)路程(P<0.01，圖2 A)，但常溫對照組母鼠和冷應激組母鼠中央平臺區(qū)路程之間無顯著差異(P>0.05，圖2 A)。冷應激組公鼠中央平臺區(qū)滯留時間顯著高于常溫對照組公鼠(P<0.01，圖2 B)，常溫對照組母鼠與冷應激組母鼠中央平臺區(qū)滯留時間之間無明顯差異(P>0.05，圖2 B)。

Fig.2The elevated plus maze of central platform activity
A：Path of central platform；B:Central platform time
**P<0.01vscontrol

2.2.3 開臂活動 冷應激組公鼠開臂進入次數(shù)顯著高于常溫對照組公鼠進入次數(shù)(P<0.01，圖3 A)，但常溫對照組母鼠和冷應激組母鼠開臂進入次數(shù)之間無顯著差異(P>0.05，圖3 A)。常溫對照組與冷應激組公鼠、母鼠的開臂進入次數(shù)百分比之間無顯著差異(P>0.05，圖3 B)。冷應激組公鼠、母鼠開臂滯留時間顯著高于常溫對照組公鼠、母鼠開臂滯留時間(P<0.01,圖3 C)。冷應激組公鼠開臂滯留時間百分比顯著高于常溫對照組公鼠(P<0.01，圖3 D)，冷應激組母鼠開臂滯留時間百分比高于常溫對照組母鼠(P<0.05,圖3 D)。

Fig.3The elevated plus maze of open arm activity
A:Number of open arm entries;B:Open arm otal arm entries;C:Open arm time;D:Open otal time
*P<0.05，**P<0.01vscontrol

2.2.4 閉臂活動 常溫對照組公鼠、母鼠與冷應激組公鼠、母鼠閉臂進入次數(shù)之間無顯著差異(P>0.05，圖4 A)。常溫對照組公鼠、母鼠與冷應激組公鼠、母鼠閉臂進入次數(shù)百分比之間無顯著差異(P>0.05,圖4 B)。常溫對照組公鼠、母鼠閉臂滯留時間顯著高于冷應激組公鼠、母鼠兩組(P<0.01,圖4 C)。常溫對照組公鼠、母鼠的閉臂滯留時間百分比顯著高于冷應激組公鼠、母鼠(P<0.01，圖4 D)。

Fig.4The elevated plus maze of closed arm activity
A：Number of closed arm entries;B:Closed arm/total arm entries;C:Closed arm time;D:Closed/total times
**P<0.01vscontrol

2.2.5 開臂和閉臂運動路程 冷應激公鼠開臂區(qū)運動路程顯著高于常溫對照組公鼠開臂區(qū)運動路程(P<0.01，圖5 A)，冷應激組母鼠開臂區(qū)運動路程高于常溫對照組母鼠開臂區(qū)運動路程(P<0.05，圖5 A)。冷應激組公鼠、母鼠開臂區(qū)運動路程百分比高于常溫對照組公鼠、母鼠開臂區(qū)運動路程百分比(P<0.05，圖5 B)。常溫對照組與冷應激組公鼠、母鼠閉臂區(qū)運動路程之間無明顯差異(P>0.05，圖5 C)。冷應激組公鼠、母鼠閉臂區(qū)運動路程百分比低于常溫對照組運動路程百分比(P<0.05，圖5 D)。

Fig.5The elevated plus maze of open arm and closed arm movement
A:Open arm area distance;B:Open arm/total distance;C:Closed arm area distance;D:Closed arm otal time
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

本實驗研究大鼠產(chǎn)前妊娠母體冷應激對子代自發(fā)、探索及焦慮行為的影響。首先在大鼠母體冷應激中，兩組除應激溫度不同以外其他飼養(yǎng)條件都相同；待其分娩以后，子代的飼養(yǎng)條件一致，減小因為環(huán)境、溫度不同帶來的誤差。其次，在曠場實驗和高架十字迷宮實驗中，每次實驗開始前，都確保實驗儀器干凈，沒有氣味殘留。操作手法都為同一個人，減少了人為造成的誤差。在曠場實驗中，總路程和速度是評價大鼠自發(fā)活動的主要數(shù)據(jù)[10]，常溫對照組與冷應激組公鼠、母鼠的總路程和速度之間無明顯差異，表明產(chǎn)前冷應激對子代自發(fā)活動無影響。大鼠的趨避性是根據(jù)在周邊區(qū)活動總時間來判斷的，常溫對照與冷應激組公鼠、母鼠的周邊總時間(四角和四邊總時間)之間無明顯差異，表明了產(chǎn)前冷應激對子代的探索行為無影響。Tooru Tazumi等在研究中發(fā)現(xiàn)冷應激大鼠子代在開場實驗中的自發(fā)行為及探索行為之間無顯著差異，這與本實驗結(jié)果一致[11]。開場實驗的趨避性結(jié)果可以提示進行深入焦慮、抑郁相關(guān)的實驗，但是在本實驗中，曠場實驗趨避性結(jié)果與高架十字迷宮不一致，可能是因為冷應激作用于母體，對子代潛在的影響需要進一步實驗印證，也有可能是母體產(chǎn)前冷應激使后代海馬區(qū)受到損害而導致子代行為發(fā)生異常[12]。

在高架十字迷宮實驗中，進臂總次數(shù)和進入閉臂次數(shù)可以整體評價大鼠的活躍程度。常溫對照組與冷應激組公鼠進臂總次數(shù)之間差異顯著(P<0.05)，而母鼠的進臂總次數(shù)無明顯差異，常溫對照組與冷應激組公鼠、母鼠進入閉臂總次數(shù)和進入閉臂次數(shù)百分比之間無明顯差異，整體上說明了產(chǎn)前冷應激對子代活躍程度無明顯影響，而在Estanislau等人的研究中，產(chǎn)前應激可以影響子代的行為，母體應激后的子代在閉臂區(qū)停留時間延長，說明產(chǎn)前應激影響子代的活躍程度，而在本實驗中并沒有此現(xiàn)象，可能因為應激的方式及強度不同所引起的[13]。在開臂的滯留時間和路程可以評價大鼠的焦慮行為[14]，焦慮行為與開臂滯留時間成反比，開臂滯留時間停留越短，表示越焦慮。常溫對照組公鼠與冷應激組公鼠、母鼠開臂滯留時間和開臂滯留時間百分比之間差異非常顯著(P<0.01)，但是冷應激組公鼠與母鼠比正常組公鼠和母鼠的開臂滯留時間長，沒有呈現(xiàn)焦慮行為，說明母體產(chǎn)前冷應激使子代的焦慮行為減少。產(chǎn)前母體冷應激后的子代面對高空并不能表現(xiàn)出恐懼、緊張，反而停留時間延長，而在Van den Hove D L A等在實驗研究中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前應激使子代在高架十字迷宮中產(chǎn)生更多的焦慮行為，即在開臂停留時間較短[15]，與本實驗結(jié)果不符。

在我國東北地區(qū)，寒冷無法避免，而妊娠期間冷應激更是造成妊娠母體發(fā)生一系列反應，使妊娠母體及子代造成不可逆的反應。在本實驗中產(chǎn)前冷應激子代在進行行為學測試時，出現(xiàn)以上這樣的結(jié)果可能是因為產(chǎn)前母體冷應激使子代的海馬發(fā)生炎癥反應，產(chǎn)生了焦慮行為減少的異常行為[16]，例如在王凌星等人的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前手機應激通過改變子代大鼠海馬 BDNF 而影響齒狀回的 PCNA 和 DCX 表達[17]；還可能是產(chǎn)前母體冷應激會影響子代的大腦邊緣區(qū)，胎兒在母體宮內(nèi)因環(huán)境改變而導致胎兒大腦合成受到影響[18-19]，影響子代的神經(jīng)發(fā)育，如王凌星等人發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前應激可能改變子代大鼠腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞上EphA4受體的表達，促進星形膠質(zhì)細胞活化，產(chǎn)生神經(jīng)蛋白聚糖[20]；也可能是母體冷應激以后，影響幼鼠的海馬CA2區(qū)發(fā)育[21]，導致子代產(chǎn)生焦慮樣行為減少的異常行為。還有可能是母體在妊娠期間進行冷應激時發(fā)生了炎癥反應，影響了子代生長發(fā)育，從而導致子代行為發(fā)生異常[22]。這些猜測為以后研究產(chǎn)前冷應激提供了新的思路。

綜上所述，產(chǎn)前冷應激對子代的自發(fā)活動、探索行為及活躍程度無顯著影響，但是使子代產(chǎn)生了焦慮行為減少的異常行為。