李 寧，楊 虎，方 振，王萍玉，韓 潔，田 蕾，閆 峻，襲著革△，劉曉華△

(1.濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050；3.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連116001)

臭氧(O3)是氮氧化物和揮發(fā)性有機(jī)物的二次污染物。近年來，光化學(xué)反應(yīng)造成的大氣O3污染逐漸變得較為嚴(yán)重，其主要來源是光化學(xué)煙霧，其次還可來源于消毒過程中紫外燈的使用等。據(jù)調(diào)查顯示，O3已逐步取代PM2.5成為某些城市夏季空氣中的主要污染物[1]。O3是一種具有高度反應(yīng)性的氧化性氣體，不易溶于水，能夠通過呼吸道進(jìn)入肺部，造成生物大分子如DNA的損傷[2]。已有研究表明，臭氧對(duì)植物、體外培養(yǎng)的微生物和細(xì)胞具有遺傳毒性，關(guān)于體外培養(yǎng)細(xì)胞的研究多集中于對(duì)淋巴細(xì)胞、A549細(xì)胞系、骨髓細(xì)胞等[3,4]，對(duì)體內(nèi)肺部細(xì)胞的遺傳毒性研究相對(duì)較少，且僅局限于某一個(gè)水平探討引起的遺傳毒性。因此，本文將在建立不同濃度臭氧急性暴露模型基礎(chǔ)上，從DNA水平及染色體水平探究臭氧急性暴露對(duì)大鼠肺部細(xì)胞的遺傳毒性。從多個(gè)水平探究遺傳毒性隨著臭氧濃度增加致肺部細(xì)胞遺傳毒性的影響，為人類暴露于臭氧條件下致機(jī)體肺部細(xì)胞損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

臭氧發(fā)生器(型號(hào)FW-120，Vonti，China)；臭氧濃度檢測(cè)儀(型號(hào)1003 AH，CA，Glendale)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(型號(hào)SpectraMax M5e,美國(guó)MD)；電泳儀(型號(hào)DYY-6C，北京六一儀器長(zhǎng))；熒光倒置顯微鏡(型號(hào)Axio Observer D1，蔡司)；8-OHdG檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(博奧拓達(dá)公司)，彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒(美國(guó)Trevigen公司)、PI(Solarbio公司)、Giemsa染液(Solarbio公司)及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

Wistar雄性大鼠，體重175～205 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房。將72只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control,n=6)、暴露組(ppm，0.12,0.5,1.0,2.0,4.0)，每組n=6。大鼠置于密閉箱中，對(duì)照組接受空氣暴露、暴露組接受臭氧制造儀生產(chǎn)的臭氧暴露，持續(xù)4 h。暴露結(jié)束24 h后，大鼠腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，取肺組織進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 肺組織單細(xì)胞懸液制備

取右肺尖，用冰預(yù)冷的PBS清洗3次，眼科剪剪碎，組織勻漿后，加入2 ml冰預(yù)冷的PBS，200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾，收集濾液，3 000 r/min 4℃離心5 min，棄去上清，用冰預(yù)冷的PBS洗滌3次，制成單細(xì)胞懸液。PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至105cells/ml。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的存活率(>90%)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法，按照試劑盒說明書對(duì)肺組織中8-OHdG進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.5 彗星實(shí)驗(yàn)

制備1%正常融點(diǎn)瓊脂糖預(yù)處理的磨砂玻片，將20 μl肺組織單細(xì)胞懸液與200 μl 1.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖混合后鋪在預(yù)處理的磨砂玻片上，固化條件為4℃，10 min。將制好的玻片浸入冰預(yù)冷的堿性裂解緩沖液(2.5% SDS和25 mM EDTA，pH=13)中20 min，用PBS洗滌3次。將其置于電泳緩沖液(30 mmol/L NaOH和1 mmol/L EDTA)中，21V、250 mA下電泳20 min。電泳結(jié)束后，將載玻片置于中和緩沖液中漂洗20 min，避光條件下進(jìn)行碘化丙啶染色。24 h內(nèi)在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄。每張載玻片上隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，放大倍數(shù)為200，用CASP軟件進(jìn)行分析。

1.6 微核實(shí)驗(yàn)

將肺組織單細(xì)胞懸液涂于干凈的載玻片上，自然晾干后，插入含甲醇固定液的槽中固定10 min，取出后放入Giemsa染色液中染色15 min，超純水沖洗，晾干，油鏡下觀察計(jì)數(shù)。遵循最常用的方法，即Z字形方法來篩選載玻片。在每張載玻片上計(jì)數(shù) 1 000個(gè)具有完整細(xì)胞核和細(xì)胞邊界的細(xì)胞。從 1 000個(gè)完整的細(xì)胞中計(jì)數(shù)MN的數(shù)量。

1.7 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)

取0.5 ml肺組織制備好的單細(xì)胞懸液，加入 0.5 ml SDS溶液，輕輕搖勻，65℃水浴加熱10 min。將100 μl Tris-HCl-KCl溶液加入到上述溶液中。充分混合后，將液體倒入1 ml聚丙烯移液器吸頭中，重復(fù)上述步驟7次，使DNA長(zhǎng)度一致。冰上預(yù)冷5 min，4℃ 10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中保存。向沉淀中加入1 ml洗滌緩沖液,65℃水浴加熱10 min。冰上預(yù)冷5 min。4℃，10 000 r/min離心5 min，收集上清到另一離心管中。向上述沉淀中加入0.5 ml洗滌緩沖液和0.5 ml蛋白酶K溶液，充分混勻。60℃水浴中加熱3 h，冰上驟冷5 min。4℃，12 000 r/min離心10 min,收集上清。用洗滌緩沖液制備各濃度的小牛胸腺DNA溶液1 ml，使其終濃度為0、50、150、250、375、500、750、1000、1500、2500 ng/ml，分別加入1 ml新鮮制備的Hoechst33258溶液(400 ng/ml)，混合均勻后，測(cè)量各組溶液的熒光強(qiáng)度，繪制DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述第三、四步驟中離心管的上清液并加入1 ml新鮮制備的Hoechst 33258溶液?；旌暇鶆蚝?，在相同條件下測(cè)量熒光值。DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)率計(jì)算公式：DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率=交聯(lián)DNA含量/(交聯(lián)DNA含量+游離DNA含量)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 急性臭氧暴露對(duì)大鼠肺組織內(nèi)8-OHdG含量的影響

由于臭氧具有強(qiáng)氧化性，8-OHdG是DNA氧化損傷的產(chǎn)物，通常檢測(cè)8-OHdG的含量可以反映出DNA氧化損傷程度。隨著臭氧濃度的升高，肺組織內(nèi)8-OHdG的含量逐漸升高，0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm臭氧暴露組與對(duì)照組相比均有顯著性差異，且在臭氧濃度為4.0 ppm時(shí)達(dá)到最大值(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Changes in 8-OHdG content in lung tissues of rats exposed to different concentrations of ozone n=6)

*P<0.05vscontrol group

2.2 臭氧急性暴露對(duì)大鼠肺部細(xì)胞DNA斷裂的影響

熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組未見拖尾的細(xì)胞，只有完整的頭部，表明細(xì)胞未發(fā)生DNA斷裂；臭氧暴露組均可觀察到拖尾的細(xì)胞，斷裂的DNA游動(dòng)移出細(xì)胞核外，形成尾部，形似彗星(圖1)。采用軟件分析圖片顯示，隨著臭氧濃度的增大，0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm暴露組的拖尾數(shù)量及拖尾長(zhǎng)度均顯著升高(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of tail length and tailing rate of lung cells in rats exposed to different concentrations of ozone n=6)

*P<0.05vscontrol group

2.3 急性臭氧暴露對(duì)大鼠肺部細(xì)胞內(nèi)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率的變化

DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA-protein crosslink,DPC)是指DNA鏈通過共價(jià)鍵的作用與蛋白質(zhì)穩(wěn)定的結(jié)合在一起，是一種較為嚴(yán)重的DNA損傷形式。與對(duì)照組相比，0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm臭氧暴露組大鼠肺部細(xì)胞內(nèi)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率均顯著性增加(P<0.05)，且在2.0 ppm時(shí)達(dá)到最大值(圖2)。

Fig.2DNA-protein cross-linking rate in rats exposed to different concentrations of ozone
*P<0.05vscontrol group

2.4 急性臭氧暴露對(duì)肺部細(xì)胞染色體水平的影響

0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm臭氧暴露組大鼠肺部細(xì)胞微核率分別為 1.4‰，1.6‰，2.0‰，2.4‰，3.0‰和3.2‰，微核率的發(fā)生與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但均隨著臭氧濃度的升高，微核的發(fā)生率增加。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)旨在探究急性臭氧暴露對(duì)肺部細(xì)胞的遺傳毒性。我們選用6個(gè)濃度進(jìn)行探究，具體計(jì)算方法參照GBz/T240“化學(xué)毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)試方法”。最大劑量為4.0 ppm，組間關(guān)系一般為2倍，選擇4～5組。平均1.0 ppm/8 h是我國(guó)環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，平均0.12 ppm/1 h是美國(guó)EPA的法定標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，極低水平的O3暴露(0.1 ppm)即可誘導(dǎo)體外細(xì)胞DNA單鏈斷裂。所以我們選用的臭氧濃度為0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm和4.0 ppm。臭氧是一種常見的城市空氣污染物，是一種高活性氧化劑。臭氧的毒理作用歸因于它能夠通過直接或間接引起膜脂和蛋白質(zhì)氧化和過氧化的能力[5]，不易溶于水，能夠通過呼吸道進(jìn)入肺部，引起生物大分子如DNA的損傷[2]，為此，我們將肺部細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行探究。

本文采用ELISA法檢測(cè)DNA氧化損傷的產(chǎn)物8-OHdG，采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA斷裂損傷，應(yīng)用KC1-SDS沉淀法對(duì)DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)情況進(jìn)行測(cè)定；采用微核試驗(yàn)檢測(cè)染色體損傷情況。在DNA氧化損傷方面，臭氧具有強(qiáng)氧化性，8-OHdG是主要的DNA氧化產(chǎn)物。已經(jīng)在臭氧污染城市的人們的呼吸道上皮細(xì)胞和尿液中以及暴露于吸入臭氧的小鼠的尿液中被鑒定，并且已經(jīng)被提出可作為由環(huán)境空氣誘導(dǎo)的氧化性DNA損傷的生物標(biāo)志物污染[6]。將Wistar大鼠暴露于2 ppm O3數(shù)小時(shí)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞中8-OHdG的表達(dá)增多，表明支氣管上皮細(xì)胞是氧化性DNA損傷的靶細(xì)胞[7]。同樣的，在我們的研究中肺組織細(xì)胞內(nèi)的8-OHdG水平隨著臭氧濃度的升高也有顯著性升高。在DNA斷裂損傷方面，彗星實(shí)驗(yàn)也稱為單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，彗星試驗(yàn)首先由Ostling和Johanson提出，用于直接觀察單個(gè)細(xì)胞中的DNA損傷。彗星尾巴是由破碎的帶負(fù)電的DNA分子從彗星頭(核心)中被拉出，并向陽極遷移形成的。尾巴的長(zhǎng)度與DNA鏈斷裂的數(shù)目有關(guān)。是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)并定量分析DNA單/雙鏈斷裂情況的較為靈敏的方法，且對(duì)檢測(cè)的細(xì)胞需求量較小、也不需細(xì)胞處于特定的時(shí)期，因此已經(jīng)被廣泛用于遺傳毒性相關(guān)的檢測(cè)[8]。有大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明O3在L929成纖維細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞以及豚鼠和人的氣管上皮細(xì)胞中引起DNA單鏈斷裂(SSB)和/或雙鏈斷裂(DSB)，其中O3濃度范圍為 0.3至5.0 ppm。段麗菊等[2]用1 ppm的O3暴露雄性BALB/c小鼠，染毒3 h和24 h后，暴露組肺細(xì)胞DNA斷裂損傷顯著高于對(duì)照組。在我們的實(shí)驗(yàn)中也有同樣的發(fā)現(xiàn)。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)是指DNA鏈通過共價(jià)鍵的作用與蛋白質(zhì)穩(wěn)定的結(jié)合在一起，是一種較為嚴(yán)重的DNA損傷形式。正常生理狀態(tài)下，各細(xì)胞為維持其生命活動(dòng)DNA與蛋白質(zhì)存在一定的聯(lián)系，即存在一定的DPC本底值，當(dāng)外源性因素對(duì)機(jī)體造成影響時(shí)，體內(nèi)的DPC升高，導(dǎo)致DNA的生理功能受到抑制或改變，從而產(chǎn)生遺傳性損傷。通常情況下DPC發(fā)生在DNA單鏈上，因此當(dāng)DPC形成并升高后，DNA正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄就會(huì)受到其阻礙，對(duì)DNA的構(gòu)象和功能也會(huì)發(fā)生一定程度的影響，并且引起染色體異常、基因突變或重于基因的丟失等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和疾病的發(fā)生。DPC作為一種嚴(yán)重的遺傳性損傷，由于其較難修復(fù)或修復(fù)錯(cuò)誤，且在細(xì)胞周期中存在時(shí)間長(zhǎng)便于檢測(cè)，已被作為一種典型的生物標(biāo)志物廣泛用于評(píng)價(jià)受試物的分子遺傳毒性[9]。

微核(micronucleus,MN)起源于染色體片段或整個(gè)染色體，它們?cè)诤朔至哑陂g不包含在主核中。MN在分裂細(xì)胞中的形成是由于未修復(fù)或錯(cuò)配的DNA損傷導(dǎo)致的染色體斷裂或由于有絲分裂故障引起的染色體異常分離造成的。它是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。因此，微核率的高低間接體現(xiàn)了染色體畸變發(fā)生率的大小，從而對(duì)染色體的受損傷情況進(jìn)行判斷。微核試驗(yàn)是評(píng)價(jià)受試物遺傳毒性的一個(gè)重要指標(biāo)，現(xiàn)已被廣泛用于評(píng)價(jià)輻射損傷、化學(xué)誘變劑及癌癥前期診斷等各個(gè)方面。在染色體損傷水平，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象均是淋巴細(xì)胞，Zelac R E等[10]在動(dòng)物的外周淋巴細(xì)胞中觀察到染色體畸變和/或姐妹染色單體交換。但是，在我們的實(shí)驗(yàn)中，隨著臭氧濃度的升高，染色體損傷的程度有升高的趨勢(shì)，但較對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

在我們選取的臭氧范圍內(nèi)，較低濃度下即可引起DNA斷裂及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。在臭氧濃度為0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm均可引起DNA斷裂損傷，而DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率隨著濃度的增加出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，說明當(dāng)染毒劑量超過一定限制時(shí)，由其所引起的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率增高的效應(yīng)有所下降，原因可能是臭氧通過多種效應(yīng)作用于DNA如 DNA斷裂,DNA 堿基突變,DNA-DNA 交聯(lián),DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等,在不同的染毒劑量下,各種機(jī)制作用所占的比重存在有差異,從而表現(xiàn)出不同的主要效應(yīng)?？傊?，本研究利用不同的方法分別從DNA水平和染色體水平探討了急性臭氧暴露對(duì)大鼠肺部細(xì)胞的遺傳毒性。結(jié)果顯示：較低的臭氧濃度即可引起肺部細(xì)胞的DNA損傷，而較高的臭氧濃度仍未見引起染色體水平的損傷，因此，對(duì)于臭氧急性暴露的肺部遺傳毒性應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注其對(duì)細(xì)胞DNA的損傷及可能的機(jī)制。

綜上所述，急性臭氧暴露對(duì)大鼠遺傳毒性的影響，在DNA斷裂方面，臭氧濃度越大，斷裂損傷越大，而DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)方面，隨著臭氧濃度的變化，出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。所以，臭氧致肺細(xì)胞遺傳毒性方面，不同的水平進(jìn)行分開檢測(cè)與描述。